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5.4. Vorbereitung der Probenlösung für die HPLC

Ein aliquoter Teil der Petrolether-Lösung (von 5.3.1 oder 5.3.2) wird in einen 250-ml-Spitzkolben ( 4.2.4) pipettiert. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck und bei einer Badtemperatur von höchstens 40 °C am Rotationsverdampfer ( 4.1) fast bis zur Trockne eingedampft. Darauf wird unter Stickstoff ( 3.9) Druckausgleich geschaffen und der Kolben vom Rotationsverdampfer abgenommen. Das restliche Lösungsmittel wird im Stickstoffstrom ( 3.9) abgeblasen, und der Rückstand wird sofort in einer definierten Menge (10-100 ml) Methanol ( 3.3) aufgenommen (die Konzentration von DL-a-Tocopherol sollte 5 µg/ml bis 30 µg/ml betragen).

5.5. Bestimmung durch HPLC

Die Abtrennung von Vitamin E erfolgt mit Hilfe einer Umkehrphasen-C₁₈-Säule ( 4.5.1), und die Konzentration wird mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors (Anregung: 295 nm, Emission: 330 nm) oder eines UV-Detektors (292 nm) ( 4.5.2) gemessen.

Hierzu wird ein aliquoter Teil (z.B. 20 µl) der nach 5.4 erhaltenen methanolischen Lösung auf die Trennsäule gegeben und mit der mobilen Phase (3.8) eluiert. Die mittleren Peakhöhen (-flächen) von mehreren Einspritzungen derselben Probenlösung werden ermittelt. In der gleichen Weise werden die mittleren Peakhöhen (-flächen) von mehreren Einspritzungen der Kalibrierlösungen ( 5.6.2) bestimmt.

HPLC-Parameter

Die folgenden Angaben sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen:

5.6. Eichung (DL-α-Tocopherol-Acetat oder DL-α-Tocopherol)

5.6.1. DL-α-Tocopherol-Acetat-Standard

5.6.1.1. Herstellen der Arbeits-Standardlösung

25 ml der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung ( 3.10.1) in einen 500-ml-Steh- oder Erlenmeyerkolben (4.2.1) pipettieren und wie unter Nummer 5.2 beschrieben hydrolysieren. Anschließend mit Petrolether ( 3.2) gemäß Nummer 5.3 extrahieren und mit Petrolether auf 500 ml auffüllen. 25 ml dieses Extrakts werden am Rotationsverdampfer (siehe 5.4) fast bis zur Trockne eingedampft, das verbleibende Lösungsmittel wird mit einem Stickstoffstrom ( 3.9) abgeblasen, und der Rückstand wird in 25,0 ml Methanol ( 3.3) aufgenommen. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 45,5 µg DL-α-Tocopherol je ml; das entspricht 50 µg DL-α-Tocopherol-Acetat je ml. Die Arbeits-Standardlösung muss vor Gebrauch frisch zubereitet werden.

5.6.1.2. Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrierkurve

1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml und 10,0 ml der Arbeits-Standardlösung werden in eine Reihe von 20-ml-Messkolben pipettiert; bis zur Marke mit Methanol ( 3.3) auffüllen und mischen. Der Sollgehalt dieser Lösungen beträgt 2,5 µg/ml, 5,0 µg/ml, 10,0 µg/ml und 25,0 µg/ml DL-α-Tocopherol-Acetat, d. h. 2,28 µg/ml, 4,55 µg/ml, 9,10 µg/ml und 22,8 µg/ml DL-α-Tocopherol.

20 µl von jeder Kalibrierlösung werden mehrmals eingespritzt, und die mittleren Peakhöhen (-flächen) werden gemessen. Unter Verwendung der mittleren Peakhöhen (-flächen) wird eine Kalibrierkurve erstellt.

5.6.1.3. UV-Kontrolle der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung ( 3.10.1)

5,0 ml der DL-α-Tocopherol-Acetat-Stammlösung ( 3.10.1) werden mit Ethanol auf 25,0 ml aufgefüllt, das UV-Spektrum dieser Lösung wird gegen Ethanol ( 3.1) im Spektralphotometer ( 4.6) zwischen 250 nm und 320 nm gemessen.

Das Extinktionsmaximum soll bei 284 nm liegen.

Bei der vorliegenden Verdünnung sollte eine Extinktion von 0,84 bis 0,88 erzielt werden.

5.6.2. DL-α-Tocopherol-Standard

5.6.2.1. Herstellen der Arbeits-Standardlösung

2,0 ml der DL-α-Tocopherol-Stammlösung ( 3.11.1) werden in einen 50-ml-Messkolben pipettiert, in Methanol ( 3.3) gelöst und bis zur Marke mit Methanol aufgefüllt. Der Sollgehalt dieser Lösung beträgt 40 µg DL-α-Tocopherol je ml; das entspricht 44,0 µg DL-α-Tocopherol-Acetat je ml. Die Arbeits-Standardlösung muss vor Gebrauch frisch zubereitet werden.

5.6.2.2. Herstellen der Kalibrierlösungen und Erstellung der Kalibrierkurve

1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml und 10,0 ml der Arbeits-Standardlösung werden in eine Reihe von 20-ml-Messkolben pipettiert; bis zur Marke mit Methanol ( 3.3