umwelt-online: Richtlinie 2006/56/EG zur Änderung der Anhänge der RL 93/85/EWG zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (2)

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6. PCR-TEST

Grundsatz

Wird der PCR-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der IF-Test durchgeführt werden. Wird der PCR-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Dieses Testverfahren wird als Hauptscreeningtest nur empfohlen, wenn es fachkundig durchgeführt werden kann.

Hinweis:

Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 10³ bis 10⁴ Zellen von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen. Möglicherweise sind Optimierungsversuche erforderlich, um in allen Laboratorien ein höchstmögliches Niveau an Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten.

Validierte PCR-Reagenzien und -Protokolle verwenden. Vorzugsweise eine Methode mit interner Kontrolle wählen.

Alle erforderlichen Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination der Probe mit Ziel-DNa zu vermeiden. Der PCR-Test ist von erfahrenen Technikern und in für molekularbiologische Arbeiten vorgesehenen Laboratorien durchzuführen, um das Risiko einer Kontamination mit Ziel-DNa auf ein Mindestmaß zu begrenzen.

Negativkontrollen (für DNA-Extraktions- und PCR-Verfahren) sind stets als letzte Probe zu behandeln, damit nach-vollziehbar bleibt, ob eine DNA-Verschleppung stattgefunden hat.

Die folgenden Negativkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

• Probenextrakt, der zuvor negativ auf C. m. subsp. sepedonicus getestet wurde,
• Pufferkontrollen, die zum Extrahieren des Bakteriums und der DNa aus der Probe verwendet werden,
• PCR-Reaktionsmischung.

Die folgenden Positivkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

• Aliquots resuspendierter Pellets, denen C. m. subsp. sepedonicus zugegeben wurde (für die Vorbereitung siehe Anlage 2),
• eine Suspension aus 10⁶ Zellen je ml C. m. subsp. sepedonicus in Wasser aus einem virulenten Isolat (z.B. NCPPB 2140 oder NCPPB 4053),
• soweit möglich während des PCR-Tests auch DNa aus positiven Kontrollproben verwenden. Um potenzielle Kontaminationen zu vermeiden, sind Positivkontrollen von den Testproben räumlich getrennt vorzubereiten.

Probenextrakte sollten möglichst frei von Erdresten sein. Daher empfiehlt sich in bestimmten Fällen, Extrakte aus gewaschenen Kartoffeln herzustellen, wenn PCR-Protokolle angewendet werden sollen.

6.1. DNA-Reinigungsmethoden

Positive und negative Kontrollproben wie oben beschrieben verwenden.

Kontrollmaterial wie die Probe(n) vorbereiten.

Es stehen diverse Methoden zur Reinigung der Ziel-DNa aus komplexen Probensubstraten zur Verfügung, wodurch PCR-Inhibitoren entfernt und andere enzymatische Reaktionen ausgeschlossen werden und die Ziel-DNa im Probenextrakt konzentriert wird.

Die folgende Methode wurde zur Verwendung mit der validierten PCR-Methode (siehe Anlage 6) optimiert.

6.1.a. Methode nach Pastrik (2000):

1. 220 μl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTa [pH 8,0]) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pipettieren.
2. 100 µl Probenextrakt zugeben und bei 95 °C für 10 Minuten in einen Thermoblock oder ein Wasserbad stellen.
3. Röhrchen 5 Minuten auf Eis kühlen.
4. 80 μl Lysozym-Stammlösung (50 mg Lysozym je ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugeben und für 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
5. 220 μl Easy DNA^® Lösung a (Invitrogen) zugeben, durch Vortexen mischen und bei 65 °C für 30 Minuten inkubieren.
6. 100 μl Easy DNA^® Lösung B (Invitrogen) zugeben und kräftig vortexen, bis das Präzipitat im Röhrchen frei fließt und die Probe gleichmäßig viskös ist.
7. 500 μl Chloroform zugeben und vortexen, bis die Viskosität nachlässt und die Mischung homogen wird.
8. Zur Phasentrennung und Ausbildung der Interphase bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren.
9. Oberphase in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überfuhren.
10. 1 ml 100 % Ethanol (- 20 °C) zugeben, kurz vortexen und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.
11. Bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren und das Ethanol vom Pellet entfernen.
12. 500 μl 80 % Ethanol (- 20 °C) zugeben und durch Invertieren des Röhrchens mischen.
13. Bei 15 000 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugieren, das Pellet bewahren und das Ethanol entfernen.
14. Pellet an der Luft oder in einer DNA-Speedvac trocknen lassen.
15. Pellet in 100 μl sterilem Reinstwasser (UPW) resuspendieren und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten stehen lassen.
16. Bei - 20 °C lagern, bis es für die PCR benötigt wird.
17. Etwa vorhandenes weißes Präzipitat abzentrifugieren und 5 μl des DNA-haltigen Überstands für die PCR verwenden.

6.1.b. Andere Methoden

Andere Methoden der DNA-Extraktion (z.B. Qiagen DNeasy Plant Kit) sind akzeptabel, sofern sie DNa aus Kontrollproben mit 10³ bis 10⁴ Zellen des Krankheitserregers je ml nachweislich ebenso wirksam reinigen.

6.2. PCR

6.2.1. Test- und Kontroll-Templates nach dem validierten Protokoll (Anlage 6) für die PCR vorbereiten. Eine Dezimalverdünnung des Proben-DNA-Extrakts (1:10 in UPW) herstellen.

6.2.2. Nach dem vorgegebenen Protokoll (Anlage 6) in einem kontaminationsfreien Umfeld eine geeignete PCRReaktionsmischung herstellen. Das validierte PCR-Protokoll ist eine multiplexe Reaktion, die auch eine interne PCR-Kontrolle enthält.

6.2.3. 5 μl DNA-Extrakt je 25 μl PCR-Reaktion in sterile PCR-Röhrchen geben.

6.2.4. Eine negative Kontrollprobe mit ausschließlich PCR-Reaktionsmischung einbeziehen und anstelle der Probe UPW zugeben, das zur Herstellung der PCR-Mischung verwendet wird.

6.2.5.