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B.42. 1. Methode

Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 429 (2002).

B.42. 1.1 Einleitung

Der lokale Lymphknoten test (local lymph node assay = LLNA) ist hinreichend validiert worden und kann daher als eigenständige Methode akzeptiert werden (1)(2)(3). Damit steht eine zweite Methode zur Bewertung des Hautsensibilisierungspotenzials von chemischen Stoffen bei Tieren zur Verfügung. Die andere Prüfmethode (B.6), namentlich der Meerschweinchen-Maximierungstest und der Bühler-Test, stützt sich auf Tests am Meerschweinchen (4).

Mit dem LLNa steht eine alternative Methode, zum Nachweis von Chemikalien mit hautsensibilisierenden Eigenschaften zur Verfügung. Ebenso wird diese Methode auch eingesetzt, um nachzuweisen, dass Chemikalien kein signifikantes Hautsensibilisierungspotenzial besitzen können. Dies bedeutet notwendigerweise nicht, dass der LLNa zwingend in jedem Fall anstelle der Meerschweinchentests eingesetzt werden muß. Vielmehr erweist sich der LLNa als gleichermaßen wertvoller Test und kann als Alternative gewählt werden, bei der im Allgemeinen keine weitere Bestätigung von positiven wie auch negativen Ergebnissen erforderlich ist.

Der LLNa bietet bestimmte Vorteile, was den wissenschaftlichen Fortschritt und Belange des Tierschutzes angeht. Bei dem LLNa wird die Induktionsphase der Hautsensibilisierung untersucht, und der Test liefert quantitative Daten für die Bewertung von Dosis-Wirkungsbeziehungen. Einzelheiten zur Validierung des LLNa und ein Bericht über die Arbeit auf diesem Gebiet sind veröffentlicht worden (5)(6)(7)(8). Zudem ist festzustellen, dass die leichten/mittelgradigen Sensibilisatoren, die als zweckmäßige positive Kontrollsubstanzen für die Tests am Meerschweinchen empfohlen werden, auch für den LLNa geeignet sind (6)(8)(9).

Beim LLNa handelt es sich um eine In-vivo-Methode. Das bedeutet, dass die kontaktsensibilisierenden Eigenschaften weiterhin an Tieren bewertet werden, allerdings kann deren Anzahl meist reduziert werden. Es kommt hinzu, dass der LLNa eine substanzielle Verfeinerung der Prüfung auf Hautsensibilisierung darstellt. Der LLNa beruht auf Überlegungen, dass während der Induktionsphase der Sensibilisierung immunologische Reaktionen durch chemische Stoffe ausgelöst werden. Anders als beim Meerschweinchentest wird beim LLNa keine Provokationsbehandlung durchgeführt. Außerdem wird beim LLNa im Gegensatz zum Meerschweinchen-Maximierungstest auf den Einsatz eines Adjuvans verzichtet. -Beim LLNa erleiden die Versuchstiere weniger Qualen. Trotz der Vorteile, die der LLNa gegenüber den herkömmlichen Tests am Meerschweinchen aufweist, sollte nicht verkannt werden, dass er auch mit gewissen Einschränkungen behaftet ist, die die Verwendung eines traditionellen Meerschweinchentests erforderlich machen können (z.B. falsch negative Ergebnisse bei bestimmten Metallen, falsch positive Resultate bei bestimmten hautreizenden Stoffen) (10).

Siehe auch Allgemeine Einleitung - Teil B.

B.42. 1.2 Prinzip der Prüfmethode

Der LLNa beruht auf dem Prinzip, dass sensibilisierende Stoffe eine primäre Lymphozytenproliferation im drainierenden Lymphknoten an der Stelle der Applikation des chemischen Stoffes induzieren. Die Proliferation verläuft proportional zur applizierten Dosis (und zur Wirksamkeit des Allergens) und bietet sich als einfache Möglichkeit an, eine objektive quantitative Messung der Sensibilisierung zu erhalten. Mit Hilfe des LLNa wird die Proliferation als Dosiswirkungs-Beziehung bewertet. Zu diesem Zweck wird die Proliferation in den Testgruppen mit der in den mit Vehikel behandelten Gruppen verglichen. Der als Stimulationsindex bezeichnete Proliferationsquotient zwischen den Testgruppen und den mit Vehikel behandelten Gruppen wird ermittelt und muss mindestens Drei betragen, ehe eine Prüfsubstanz für eine weitere Bewertung als potenzieller Hautsensibilisator infrage kommt. Die hier beschriebenen Methoden beruhen auf der Nutzung der radioaktiven Markierung zur Messung der Zellproliferation. Allerdings kann man sich bei der Bewertung der Proliferation auch auf andere Endpunkte stützen, sofern dies gerechtfertigt und entsprechend wissenschaftlich begründet ist. Dazu gehören auch vollständige Zitate und die Beschreibung der Methodik.

B.42. 1.3 Beschreibung der Prüfmethode

B.42. 1.3.1 Vorbereitungen

B.42. 1.3.1.1 Haltungs- und Fütterungsbedingungen

Die Tiere sollen einzeln gehalten werden. Die Temperatur im Versuchstierraum soll 22 °C (± 3 °C) betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30°%o betragen und zu anderen Zeiten als während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70% liegen soll, ist ein Wert von 50-60% anzustreben. Der Raum soll künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist.

B.42. 1.3.1.2 Vorbereitung der Versuchstiere

Die Tiere werden nach Zufallskriterien ausgewählt, zwecks Identifizierung markiert (aber nicht am Ohr) und für die Dauer von mindestens 5 Tagen vor Versuchsbeginn in ihren Käfigen gehalten, damit sie sich an die Laborbedingungen gewöhnen können. Vor Behandlungsbeginn werden alle Tiere auf sichtbare Hautverletzungen untersucht.

B.42. 1.3.2 Versuchsbedingungen

B.42. 1.3.2.1 Versuchstiere

Für diesen Test ist die Maus die Spezies der Wahl, wobei junge erwachsene weibliche Mäuse (CBA/Ca- bzw. CBA/J-Stamm) verwendet werden, die weder geworfen haben noch trächtig sind. Bei Versuchsbeginn sollen die Tiere 8-12 Wochen alt sein, die Gewichtsunterschiede minimal sein und 20 % des mittleren Gewichts nicht übersteigen. Tests an anderen Stämmen und männlichen Tieren können erfolgen, wenn anhand von hinlänglich großen Datenangaben nachgewiesen werden kann, dass keine signifikanten stamm- oder geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Reaktion auf den LLNa bestehen.

B.42. 1.3.2.2 Überprüfung der Zuverlässigkeit

Anhand von positiven Kontrollen wird die ordnungsgemäße Durchführung des Tests und die Fähigkeit des Labors nachgewiesen, den Test erfolgreich durchzuführen. Die positive Kontrolle soll eine positive Reaktion auf den LLNa bei einem Expositionsniveau hervorrufen, das einen Anstieg des Stimulationsindex (SI >3 im Vergleich zur negativen Kontrollgruppe) bewirkt. Die positive Kontrolldosis soll so gewählt werden, dass die Induktion deutlich, aber nicht exzessiv ist. Bevorzugte Stoffe sind Hexylcinnaminaldehyd (CAS-Nr. 101-86-0, EINECS-Nr. 202-983-3) und Mercaptobenzothiazol (CAS-Nr. 149-30-4, EINECS-Nr. 205-736-8). Unter bestimmten Umständen können in ausreichend begründeten Fällen andere Kontrollsubstanzen eingesetzt werden, die den genannten Kriterien entsprechen. Obwohl üblicherweise für jeden Test eine positive Kontrollgruppe erforderlich ist, können die Prüflabors unter Umständen auf bereits vorhandene positive Kontrolldaten zurückgreifen, die belegen, dass eine zufrieden stellende Reaktion über einen Zeitraum von mindestens sechs Monaten durchgängig gegeben ist. In diesen Fällen könnten Tests mit positiven Kontrollen in größeren Abständen ausreichen, wobei zwischen zwei Tests nicht mehr als sechs Monate liegen sollen. Zwar soll die positive Kontrollsubstanz in dem Vehikel geprüft werden, von dem bekannt ist, dass es eine gleich bleibende Reaktion hervorruft (z.B. Aceton/Olivenöl), doch können aufgrund bestimmter zulassungsrechtlicher Anforderungen auch Tests in einem Nichtstandard-Vehikel (klinisch/chemisch relevante Zubereitung) erforderlich sein. In diesen Fällen soll die mögliche Interaktion einer positiven Kontrolle mit diesem unüblichen Vehikel geprüft werden.

B.42. 1.3.2.3 Anzahl der Versuchstiere, Dosierungen und Auswahl des Vehikels

Mindestens vier Tiere pro Dosisgruppe mit jeweils mindestens drei Konzentrationen der Prüfsubstanz werden benötigt; zusätzlich braucht man eine negative Kontrollgruppe, die nur mit dem Vehikel für die Prüfsubstanz behandelt wird, und gegebenenfalls auch eine positive Kontrolle. Sofern Daten auf Einzeltierbasis erhoben werden sollen, werden mindestens fünf Tiere pro Dosierungsgruppe benötigt. Außer der Behandlung mit Prüfsubstanz sollen die Tiere in den Kontrollgruppen genauso behandelt werden wie die Tiere in den Behandlungsgruppen.

Die Auswahl der Dosierung und des Vehikels soll anhand der Empfehlungen im Literaturhinweis (1) erfolgen. Für die Dosierungen werden folgende abgestufte Konzentrationen gewählt: 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% usw. Vorhandene Angaben über die akute Toxizität und Hautreizung sollten bei der Festlegung von drei aufeinander folgenden Konzentrationen berücksichtigt werden, so dass bei der höchsten Konzentration einerseits die Exposition maximiert und andererseits eine systemische Toxizität und eine übermäßige lokale Hautreizung vermieden wird (2)(11).

Das Vehikel sollte so gewählt werden, dass die Testkonzentrationen und die Löslichkeit maximiert und gleichzeitig eine für das Applizieren der Prüfsubstanz geeignete Lösung/Suspension hergestellt werden kann. Vorzugsweise werden folgende Vehikel in der genannten Reihenfolge eingesetzt: Aceton/Olivenöl (4:1, v/v), Dimethylformamid, Methylethylketon, Propylenglycol und Dimethylsulfoxid (2)(10), wobei auch andere Vehikel verwendet werden können, sofern dies hinlänglich wissenschaftlich begründet wird. Unter bestimmten Umständen muss möglicherweise ein klinisch relevantes Lösungsmittel oder die handelsübliche Zubereitung, die die Prüfsubstanz enthält, als zusätzliche Kontrolle genutzt werden. Besondere Sorgfalt sollte darauf verwendet werden zu gewährleisten, dass in das Vehikelsystem hydrophile Stoffe eingearbeitet werden, die die Haut befeuchten und nicht sofort ablaufen. Folglich sind vollständig wässrige Vehikel zu vermeiden.

B.42. 1.3.3 Prüfmethode

B.42. 1.3.3.1 Versuchsplan

Der Versuchsplan ist wie folgt:

• Tag 1 :
  Jedes Tier wird einzeln gekennzeichnet und gewogen und das Gewicht protokolliert. Es werden 25 pl der Prüfsubstanz in der jeweiligen Verdünnung, des Vehikels alleine bzw. (gegebenenfalls) der positiven Kontrolle offen auf die Rückseite jedes Ohrs appliziert.
• Tag 2 und 3:
  Die am Tag 1 durchgeführte Applikationsprozedur wird wiederholt.
• Tag 4 und 5:
  Keine Behandlung.
• Tag 6 :
  Jedes Tier wird gewogen und das Gewicht protokolliert. Es werden 250 µl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 20 µCi (7,4E + 8Bq) von³H-Methylthymidin in die Schwanzvenen der Mäuse in den Test- und Kontrollgruppen injiziert, oder es können auch. 250 µL PBS mit 2 µCi (7,4E + 7Bq) von¹²⁵I-Ioddeoxyuridin und 10^-5 M Fluordeoxyuridin injiziert werden.
  Fünf Stunden später werden die Tiere getötet. Die drainierenden aurikulären Lymphknoten werden entfernt und für jede der Versuchsgruppen in PBS gepoolt (Methode der gepoolten Behandlungsgruppe); wahlweise können die Lymphknoten einzelner Tiere paarweise entfernt und für jedes Tier in PBS gepoolt werden (Einzeltiermethode). Weitere Einzelheiten und Diagramme der Lymphknotenidentifizierung und -dissektion sind Anhang 1 zum Literaturhinweis 10 zu entnehmen.

B.42. 1.3.3.2 Herstellung der Zellsuspensionen

Durch vorsichtigen mechanischen Aufschluss in einem Edelstahlfilter (Maschenweite: 200 µm) wird eine einzige Zellsuspension aus den Lymphknotenzellen (LKZ) der gepoolten Behandlungsgruppen bzw. aus den einzelnen Tieren paarweise entnommenen LKZ hergestellt. Die Lymphknotenzellen werden zweimal mit einem Überschuss an PBS gewaschen und bei 4 °C 18 Stunden lang mit 5%iger Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Die Pellets werden entweder in 1 ml TCa resuspendiert und in Szintillationsfläschchen eingetragen, die 10 ml einer Szintillationsflüssigkeit für die³H-Zählung enthalten, oder direkt in Gammazähler zur¹²⁵I-Bestimmung überführt.

B.42. 1.3.3.3 Bestimmung der Zellpreiiteration (au/genommenen Radioaktivität)

Die Aufnahme von³H-Methylthymidin wird mittels (3-Szintillationszählung als Zerfallsereignisse pro Minute (disintegrations per minute = DPM) gemessen. Die Aufnahme von¹²⁵I-Ioddeoxyuridin wird mittels¹²⁵I-Zählung bestimmt und ebenfalls als DPM angegeben. In Abhängigkeit von der genutzten Methode wird die Aufnahme als DPM pro Behandlungsgruppe (Methode der gepoolten Behandlungsgruppe) oder als DPM pro Tier (Einzeltiermethode) angegeben.

B.42. 1.3.3.4 Beobachtungen

B.42. 1.3.3.4.1 Klinische Beobachtungen

Einmal täglich sollten die Tiere sorgfältig auf klinische Zeichen, d. h. lokale Reizung an der Applikationsstelle oder auf systemische Toxizität, untersucht werden. Sämtliche Beobachtungen werden systematisch in Einzelprotokollen dokumentiert, die für jedes Tier geführt werden.

B.42. 1.3.3.4.2 Körpergewicht

Im Abschnitt 1.3.3.1 wurde bereits ausgeführt, dass das Körpergewicht der einzelnen Tiere zu Versuchsbeginn und zum Zeitpunkt der Tötung der Tiere laut Versuchsplan ermittelt werden soll.

B.42. 1.3.4 Berechnung der Ergebnisse

Die Ergebnisse werden als Stimulationsindex (SI) angegeben. Bei Einsatz der Methode mit der gepoolten Behandlungsgruppe erhält man den SI, indem die für jede Behandlungsgruppe ermittelte Gesamtaufnahme an Radioaktivität durch die Aufnahme in der gepoolten Vehikel-Kontrollgruppe dividiert wird: dadurch erhält man den mittleren SI. Bei Anwendung der Einzeltiermethode ergibt sich der Sl durch Teilen der mittleren DPM pro Tier innerhalb jeder Behandlungsgruppe und der Positivkontrollgruppe durch die mittleren DPM pro Tier für die Vehikelkontrollgruppe. Der durchschnittliche SI beträgt für die mit Vehikel behandelten Kontrollen demnach 1.

Wird zur Berechnung des SI die Einzeltiermethode herangezogen, kann eine statistische Analyse der Daten durchgeführt werden. Bei der Auswahl einer geeigneten Methode für die statistische Analyse sollte sich der Prüfer möglicher ungleicher Varianzen und anderer damit zusammenhängender Probleme stets bewusst sein, denn diese erfordern unter Umständen eine Datentransformation oder ein nichtparametrisches statistisches Verfahren. Ein angemessener Ansatz zur Interpretation der Daten besteht darin, alle Einzeldaten der behandelten und der mit Vehikel behandelten Kontrollen auszuwerten und daraus die am besten angepasste Dosis-Reaktions-Kurve abzuleiten, wobei die Vertrauensgrenzen zu berücksichtigen sind (8)(12)(13). Jedoch sollte der Prüfer auf mögliche "Ausreißer"- Reaktionen bei einzelnen Tieren innerhalb einer Gruppe achten, die unter Umständen die Verwendung eines anderen Gradmessers für die Reaktion (z.B. Median anstelle des Mittelwerts) oder die Eliminierung des "Ausreißers" erforderlich machen.

Der Entscheidungsprozess hinsichtlich einer positiven Reaktion umfasst einen Stimulationsindex von> 3 sowie die Berücksichtigung der Dosiswirkung und gegebenenfalls auch der statistischen Signifikanz (3)(6)(8)(12)(14).

Sofern Klärungsbedarf in Bezug auf die Ergebnisse besteht, sollten die verschiedenen Eigenschaften der Prüfsubstanz beachtet werden, wobei es unter anderem zu klären gilt, ob ein struktureller Zusammenhang mit bekannten Hautsensibilisatoren besteht, ob sie eine übermäßig starke Hautreizung hervorruft und wie die festgestellte Art der Reaktion bezüglich der Dosis ist. Diese und weitere Aspekte werden an anderer Stelle ausführlich erörtert (7).

B.42. 2 Daten

Die Daten sollten in tabellarischer Form zusammengefasst werden und sowohl den Mittelwert und die DPM-Einzelwerte als auch die Stimulationsindizes für die einzelnen Dosierungsgruppen (einschließlich der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe) umfassen.

B.42. 3 Berichterstattung

Prüfbericht

Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

Prüfsubstanz:

Angaben zur Identität (z.B. CAS-Nummer, falls vorhanden; Bezugsquelle; Reinheit; bekannte Verunreinigungen; Chargennummer);

physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften (z.B. Flüchtigkeit, Stabilität, Löslichkeit);

• bei Mischungen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile in Prozent.

Vehikel:

• Angaben zur Identität [Reinheit; (gegebenenfalls) Konzentration; Einsatzvolumen ];
• Begründung der Auswahl des Vehikels.

Versuchstiere:

• verwendeter Mäusestamm;
• mikrobiologischer Status der Tiere, sofern bekannt;
  Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;
• Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.

Prüfbedingungen:

Angaben zur Herstellung und Applikation der Prüfsubstanz;

• Begründung der gewählten Dosierung mit Ergebnissen des eventuell durchgeführten Dosisfindungstests;
  Konzentrationen des Vehikels und der Prüfsubstanz sowie Gesamtmenge der applizierten Substanz;
• Angaben zur Futter- und Wasserqualität (einschließlich Art/Herkunft des Futters, Herkunft des Wassers).

Zuverlässigkeitsprüfung:

• zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse der letzten Zuverlässigkeitsprüfung mit Angaben zu verwendeten Substanzen, Konzentrationen und Vehikel;
• übereinstimmende und/oder frühere positive und negative Kontrolldaten für das Prüflabor.

Ergebnisse:

• Gewicht der einzelnen Tiere bei Beginn der Prüfung und zum Zeitpunkt der Tötung gemäß Versuchsplan;
• tabellarische Darstellung der mittleren (Methode der gepoolten Behandlungsgruppe) oder individuellen (Einzeltiermethode) DPM-Werte sowie die Bandbreite beider Methoden und der Stimulationsindizes für die einzelnen Dosierungsgruppen (einschließlich der mit Vehikel behandelten Kontrollgruppe);
• gegebenenfalls statistische Analyse;
• zeitlicher Verlauf des Einsetzens der Toxizität und Anzeichen der Toxizität, einschließlich einer möglichen Hautreizung an der Applikationsstelle, bei jedem Tier.

Diskussion der Ergebnisse:

• kurze Auswertung der Ergebnisse, der Dosiswirkungdbeziehung und gegebenenfalls statistische Analysen mit Schlussfolgerungen zur Frage, ob die Prüfsubstanz als Hautsensibilisator eingestuft werden soll.

B.42. 4 Literatur

1. Kimber, 1., und Basketter, D.A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: a commentary. Food and Chemical Toxicology 30, 165-169.
2. Kimber, 1., Derman, R.J., Scholes, E.W., und Basketter, D.A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicology, 93, 13-31.
3. Kimber, 1., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E., Hastings, K.L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the Iocal lymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal of Toxicology and Environmental Health, 53, 563-79.
4. Prüfmethode B.6.
5. Chamberlain, M., und Basketter, D.A. (1996). The local lymph node assay: Status of validation. Food and Chemical Toxicology, 34, 999-1002.
6. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, 1., und Loveless, S.E (1996). The local lymph node assay- a viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology, 34, 985-997.
7. Basketter, D.A., Gerberick, G.F., und Kimber, 1. (1998). Strategies for identifying falle positive responses in predictive sensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, 327-33.
8. Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J., Van Loveren, H. (200(1). a quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employement of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146, 49-59.
9. Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A., und Kimber, 1. (1998). Temporal stability of Iocal lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal of Applied Toxicology, 18, 281-4.
10. National Institute of Environmental Health Sciences (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: a Test Method for Assessing the Allergie Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee an the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494, Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
11. Prüfmethode B.4.
12. Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W., Lees, D., Kimber, 1., und Botham, P.A. (1993). Results with OECD recommended positive control sensitisers in the maximisation, Buehler and Iocal lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31, 63-67.
13. Basketter, D.A., Lea, L.J., Dickens, A., Briggs, D., Pate, 1., Dearman, R.J., Kimber, 1. (1999). a comparison of statistical approaches to the derivation of EC3 values from local lymph node assay dose responses. J. Appl. Toxicology, 19, 261-266.
14. Basketter, D.A, Blaikie, L, Derman, R.J., Kimber, 1., Ryan, C.A., Gerberick, G.F., Harvey, P., Evans, P., White, I.R., und Rycroft, R.T.G. (200(1). Use of local lymph node assay for the estimation of relative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42 ,344-48.

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