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Archiv: 2008

Nach § 4 Absatz 3 des Tierseuchengesetzes in der Fassung der Bekanntmachung vom 22. Juni 2004 (BGBl. I S. 1260), das zuletzt durch Artikel 4 Absatz 88 des Gesetzes vom 7. August 2013 (BGBl. I S. 3154) geändert worden ist, veröffentlicht das Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) eine amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs für anzeigepflichtige Tierseuchen. Nachstehend wird das die Bovine Virusdiarrhoe betreffende Kapitel der amtlichen Methodensammlung für anzeigepflichtige Tierseuchen bekannt gemacht.

Diese Bekanntmachung ersetzt die Bekanntmachung vom 30. Oktober 2008 (BAnz. S. 3999).

16 Bovine Virus Diarrhoe (BVD)

16.1 Charakterisierung der Infektion

16.1.1 Erreger

Der Erreger bildet gemeinsam mit dem Virus der Klassischen Schweinepest und dem Border Disease Virus das Genus Pestivirus in der Familie der Flaviviridae. Atypische Pestiviren ("Giraffe", "Pronghorn", "HoBi", "Bungowannah") sind beschrieben, für die aktuelle BVD-Epidemiologie aber von marginaler Bedeutung. Es werden zwei Genotypen des BVDV als selbständige Spezies unterschieden, bei denen jeweils zytopathogene (cp) und nichtzythopathogene (ncp) Biotypen vorkommen. Subtypisierungen auf genomischer Ebene sind möglich. Es handelt sich um ein 40 bis 60 nm großes, behülltes Virus, das Genom besteht aus einer einsträngigen RNA positiver Polarität von einer Länge von ca. 12 kB.

16.1.2 Klinische Symptomatik

Akute Infektionen verlaufen in der Regel symptomlos, vor allem bei Kälbern können Fieber, Inappetenz, seröser Nasenausfluss, milde Atemwegserkrankung oder Durchfall auftreten, bei Kühen kann es zum Rückgang der Milchleistung kommen. Eine Immunsuppression begünstigt andere Infektionen. Darüber hinaus kann BVDV, insbesondere vom Genotyp 2, verlustreiche Erkrankungen unter dem Bild eines hämorrhagischen Syndroms mit schwerer pulmonaler Symptomatik, blutiger Diarrhoe und Erosionen im Verdauungstrakt verursachen.

Eine Infektion trächtiger Tiere resultiert in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Infektion in Fruchtbarkeitsstörungen (Umrindern infolge Fruchtretention), Aborten, Totgeburten, Missbildungen und Geburt von lebensschwachen Kälbern. Bei Infektionen zwischen dem 30. und dem 90. Graviditätstag mit BVDV von ncp-Biotyp werden persistent virämische Kälber geboren, die entweder kümmern, aber sich auch normal entwickeln können. Innerhalb der ersten 12 Lebensmonate kommt es bei etwa der Hälfte der PI-Tiere zur Ausbildung von Mucosal Disease.

Mucosal Disease (MD) entsteht, wenn persistent virämische Tiere mit einem cp BVDV infiziert werden, bzw. (häufiger) wenn der ncp Biotyp im Tier zum cp Virus mutiert. Chronische Abmagerung, Fieber, Anorexie, blutige, therapieresistente Durchfälle, Speichelfluss, Erosionen im Bereich des harten Gaumens, am Flotzmaul und Naseneingang, weniger häufig im Zwischenklauenspalt sowie an Kronsaum und Euter treten auf.

Die Erkrankung verläuft tödlich. Auf pathogenetisch von der MD abzugrenzende erosive Veränderungen nach akuter Infektion mit besonders virulenten Virusstämmen wird hingewiesen (MD-like).

16.1.3 Pathologie

Zur pathologischanatomischen Untersuchung gelangen in erster Linie an MD verendete Tiere. Neben der bereits klinisch sichtbaren erosiven und ulzerativen Stomatitis (besonders harter Gaumen, Gingiva, Papillen der Backenschleimhaut), finden sich längliche Erosionen im gesamten Oesophagus, an Pansenpfeilern und an den Rändern der Blättermagenschleimhaut, in Labmagen und im gesamten Darm. Auch bei ausgeprägten pathomorphologischen Befunden ist mitunter kein Virus nachweisbar. Hochvirulente ncp-BVDV-Stämme führen zu hochgradiger Thrombozytopenie mit nachfolgendem hämorrhagischem Syndrom.

Intrauterine Infektionen bis zum 100. Graviditätstag führen zum Tod des Fetus, zu Aborten, mumifizierten Früchten bzw. Entstehung von PI-Tieren. Zu den nach Infektionen nach dem 100. Graviditätstag auftretenden Missbildungen zählen Mikroenzephalie, zerebellare Hypoplasia, Hydranenzephalie, Hydrozephalus, Mikrophthalmie ("okulozerebellares Syndrom"), Thymusaplasie, Hypotrichosis congenita, Brachygnathie, Wachstumsverzögerung und Hypoplasie der Lungen.

16.1.4 Differentialdiagnostik

Bösartiges Katarrhalfieber, Rinderpest, Maul- und Klauenseuche und andere vesikuläre Erkrankungen, Stomatitis papulosa, Verätzungen, Intoxikationen.

16.1.5 Diagnostische Indikation

• Antigen-, Genom- und Antikörperuntersuchungen nach BVD-Verordnung.
• Klinischer und/oder pathologischer Verdacht auf MD bzw. Vorliegen eines hämorrhagischen Syndroms.

6.1.6 Zuständige Untersuchungseinrichtungen

• Veterinäruntersuchungseinrichtungen in den Ländern
• Nationales Referenzlabor für BVD/MD am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems (Telefon: 03 83 51 70.212) - Abklärungsuntersuchungen

16.1.7 Rechtsgrundlagen

• Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus - BVDV-Verordnung - om 11. Dezember 2008 in der Fassung der Bekanntmachung vom 4. Oktober 2010 (BGBl. I S. 1320, 1498), die durch Artikel 1 der Verordnung vom 17. Dezember 2010 (BGBl. I S. 2131) geändert worden ist
• Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestric Animals, Chapter 2.10.6, Bovine Viral Diarrhea, 5th edition, 2004

16.2 Untersuchungsmaterialien und Probenschemata

Der diagnostische Nachweis von persistent BVDV-infizierten Rindern kann durch die Aufnahme von BVDV-antikörperhaltigem Kolostrum beeinträchtigt sein (diagnostische Lücke). Die Einschränkungen hängen von den aufgenommenen Antikörpermengen, der angewendeten Methode sowie vom Zeitpunkt der Probennahme ab. Im Folgenden werden zulässige diagnostische Verfahren zur Zertifizierung der BVD-Unverdächtigkeit eines Rindes bzw. Rinderbestandes und zur Bestätigung der Antikörperfreiheit unter Berücksichtigung der diagnostischen Lücke aufgeführt. Detaillierte Protokolle sind im Abschnitt Untersuchungsgang beschrieben.

16.2.1 Anerkannte Untersuchungen zum BVDV-Nachweis

16.2.1.1 Amtlich zugelassene E^RNS-Antigenfänger-ELISA

16.2.1.2 Amtlich zugelassene p80-Antigenfänger-ELISA

16.2.1.3 RT-PCR mit amtlich zugelassenen Testkits

16.2.1.4 Virusisolierung auf permissiven bovinen Zellkulturen, z.B. KOP-R-Zellen oder primäre bovine Zellkulturen

16.2.1.5 Antigennachweis mittels Immunfluoreszenz

16.2.1.6 Durchflusszytometrische Analyse nach Immunfluoreszenzfärbung mit p80-spezifischen Antikörpern Probenmaterial: Aufgereinigte Leukozyten aus mindestens 50 μl Vollblut.

Probennahme: Vor Aufnahme von Kolostrum oder im Alter von mehr als 90 Tagen.

16.2.2 Bestätigungsuntersuchung

Bei der Bestätigung von vermutlich persistent infizierten Tieren durch eine zweite Untersuchung muss die unterschiedliche Sensitivität der beschriebenen Methoden berücksichtigt werden. Es sind folgende Untersuchungsabstände einzuhalten:

Ein negativer Befund kann bereits vor Ablauf dieser Fristen erhoben werden.

16.2.3 Anerkannte Untersuchungen auf BVDV-Antikörper

Alle BVDV-Antikörper-Tests müssen die BVDV-Referenzseren Refl -BVDV1 und Ref3-BVDV2 (Bezug: NRL am FLI) sicher erkennen lassen.

16.2.3.1 Testsysteme für die Bestätigung der Antikörperfreiheit

• Neutralisationstest gegen BVDV-Typ 1 und BVDV-Typ 2 mit 100 KID₅₀ Testvirus (Goldstandard).
• Zugelassene BVDV-p80-blocking-ELISAs.
• Zugelassene indirekte BVDV-Antikörper-ELISAs.

16.2.3.2 Testsysteme für die diagnostische Stichprobe (z.B. "Jungtierfenster")

• Zugelassene indirekte BVDV-Antikörper-ELISA (ab einem Alter von 6 Monaten).
• Neutralisationstest gegen BVDV Typ 1 und BVDV Typ 2 (BVDV-1/2-NT) mit 100 KID₅₀ Testvirus (ab einem Alter von 9 Monaten).
• Zugelassene BVDV-p80-blocking ELISA (ab einem Alter von 9 Monaten).

Die unterschiedliche zeitliche Einschränkung erfolgt aufgrund der unterschiedlich hohen Sensitivität der Testsysteme für kolostrale Antikörper.

Ein negativer Befund dieser Teste ist auch im jüngeren Alter für die Stichprobenbeurteilung geeignet.

16.2.3.3 Testsysteme für die Untersuchung von Einzel- und Tankmilchproben

Alle für die Untersuchung von Milch zugelassenen Testsysteme. Es ist ausschließlich eine Differenzierung in "Milchpositive" und "Milchnegative" Bestände vorzunehmen.

16.3 Untersuchungsgang

16.3.1 Erregernachweis

16.3.1.1 Virusisolierung

Leukozyten

Hämolyse und Waschen der Leukozyten, z.B. 1,5 ml EDTA-Blut + 4,5 ml Lysispuffer (8,29 g/I NH4CL, 1,0 g/I KHCO3, 1 mM EDTA), 10 min Eis, Zentrifugation bei 1.000 rpm für 5 min bei 4 °C, zweimal Waschen mit Zellkulturmedium + Antibiotika (z.B. Gentamycin, 50 ng/ml; Baytril, 20 μg/ml; oder Penicillin/Streptomycin), Resuspendierung. In der Aufarbeitung sollten >10⁶ Leukozyten sein.

Alternativ: 5 bis 10 ml EDTA-Blut mit 1 ml Dextransulfatlösung versetzen und nach vorsichtigem Schwenken etwa 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur (alternativ 30 min bei 37 °C) stehen lassen. In dieser Zeit setzen sich die Erythrozyten ab. Den leukozytenhaltigen milchigtrüben Überstand absaugen und für 10 min bei 2.000 g zentrifugieren. Das Sediment wird nach zweimaligem Waschen in je 5 ml Ca-Mgfreier phosphatgepufferter Salzlösung (PBS-minus) in 2 ml Kulturmedium aufgenommen.

Die konzentrierte Leukozytensuspension dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei -70 °C gelagert werden.

Organmaterial

Ca. 1 g Organmaterial wird mit der Schere fein zerkleinert und in 10 Vol serumfreiem Zellkulturmedium bzw. isotonischem Puffer mit Antibiotika in einem Mörser, bei Notwendigkeit mit sterilem Seesand homogenisiert. Andere Methoden der Homogenisierung (Homogenisatoren, tissue lyser) sind möglich. Nach mindestens einstündiger Aufbewahrung bei 4 bis 8 °C wird die Organsuspension für 15 min bei 3.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand dient als Inokulum für die weiteren Arbeitsschritte. Für den späteren Gebrauch kann das Material bei -70 °C gelagert werden.

Inokulation der Zellkulturen

Wie o. a. aufbereitetes Untersuchungsmaterial wird im Doppelansatz in einem Volumen, das 1/10 des Zellkulturmediums entspricht (z.B. 0,1 ml für 24 well, 0,3 ml für 6 well, 0,5 ml für TC12,5 usw.) auf 1 bis 2 Tage gewachsene Zellkulturen, von denen das Anzuchtmedium vorher entfernt wurde, inokuliert. Nach einer Adsorptionszeit von 30 bis 60 min bei 37 °C, wird das Inokulum entfernt (nicht bei frischem Leukozytenpellet) und nach ein- bis zweimaligem Waschen serumfreies Erhaltungsmedium zugegeben. Positiv- und Negativkontrollen sind mitzuführen. Die Zellkulturen werden 3, besser 5 Tage bei 37 °C inkubiert. Während dieser Zeit werden die Zellkulturen auf das Auftreten zytopathischer oder zelttoxischer Effekte mikroskopisch kontrolliert. Die Zellkulturplatten können anschließend einer Immunfärbung unterzogen werden, die Kulturflaschen werden nach Gefrier-Tau-Zyklus weiter passagiert bzw. auf Zellkulturplatten mit dem Ziel einer Immunfärbung weiterverimpft. Es werden in der Regel bis zu drei Passagen durchgeführt.

Immunfärbung

Fixation

Das Kulturmedium wird abgesaugt, der Zellrasen einmal mit Waschpuffer (PBS, IP, TBST) gewaschen und luftgetrocknet (Fön oder über Nacht bei Raumtemperatur [RT]). Die Fixierung erfolgt im Wärmeschrank für 2 h bei 80 °C. Alternative laborübliche Fixationsmethoden (z.B. 80 % Azeton, 4 % Paraformaldehyd) können angewendet werden, wenn ihre Eignung gezeigt wurde.

Die Platten können für 2 bis 3 Tage im Kühlschrank gelagert werden oder werden bei -20 °C über längere Zeit aufbewahrt.

Immunfärbung

Die Immunfärbung kann direkt mit einem geprüften BVDV- bzw. panpesti-Konjugat durchgeführt werden. Alternativ besteht die Möglichkeit, indirekt mit einem geeigneten monoklonalen Antikörper und einem FITC-, bzw. PODmarkierten Anti-Maus-Konjugat zu färben.

Durchführung der Fluoreszenzfärbung

Direkte Methode

• Zugabe von 50 bis 100 μl eines Fluorochrom- (z.B. FITC-) markierten Antikörpers in Verdünnungspuffer (PBS, IP, TBST), bei Bedarf 0,001 % Evans blue,
• Inkubation bei RT für 60 min, dreimal Waschen (zweimal kurz, einmal 10 min) in Waschpuffer (PBS, IP, TBST), Puffer absaugen, einmal Waschen mit Aqua dest (A. dest), Überschichten mit A. dest oder Fluoreszenzerhaltungspuffer (1/1 mit A. dest),
• Auswertung im inversen Fluoreszenzmikroskop.

Indirekte Methode

• Zugabe von 50 bis 100 μl eines antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers (z.B. WB103/105, c.c.pro) in Gebrauchsverdünnung in Verdünnungspuffer.
• Inkubation bei RT für 60 min, Absaugen des Antikörpers, einmal Waschen in Waschpuffer.
• Zugabe von 50 bis 100 μl FITC-Anti-Maus-IgG (z.B. Firma DAKO Best.-Nr. F0479) in Gebrauchsverdünnung (bei Zugabe von Evans blue - 0,001 % Endkonzentration).
• Inkubation bei RT für 60 min, Absaugen des Konjugates.
• Dreimal Waschen mit Waschpuffer (zweimal kurz, einmal 10 min).
• Absaugen des Puffers, einmal Waschen mit A. dest.
• Überschichten Zellen mit A. dest oder Fluoreszenzerhaltungspuffer (1/1 mit A. dest).

Durchführung der Peroxydasefärbung (indirekt)

• Zugabe von 50 bis 100 μl eines antigenspezifischen monoklonalen Antikörpers (z.B. Wb103/105) in Gebrauchsverdünnung in Verdünnungspuffer (TBST) Inkubation bei RT für 60 min, Absaugen des Antikörpers, einmal Waschen in Waschpuffer (TBST).
• Zugabe von 50 bis 100 μl POD-Anti-Maus-IgG (z.B. Sigma, A-9044) in Gebrauchsverdünnung.
• Inkubation bei RT für 60 min, Absaugen des Konjugates.
• Waschen der Zellen in Waschpuffer (TBST) (zweimal kurz, einmal 10 min).
• Absaugen des Puffers.
• Substratreaktion:
• Dazu wird 1 Tablette AEC (3-amino-9-Ethylcarbazol) in 2,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst (Stammlösung). Zur Anwendung werden für eine Platte 0,25 ml Stammlösung in 5 ml 0,05 M Natriumazetatpuffer, pH 5,0 verdünnt, mit 15 μl 3 % H₂O₂ versetzt und je 50 μl/well pipettiert. Nach 15 min wird die Färbelösung abgesaugt und mit A. dest aufgefüllt.
• Die AEC-Stammlösung wird portioniert bei -20 °C gelagert.

Achtung, AEC ist kanzerogen! (Laborhandschuhe tragen)

Phänotypische Differenzierung zwischen BVDV-1 und BVDV-2

Die parallele Anwendung der monoklonalen Antikörper WB103/105 (c.c.pro) und WB 160 (c.c.pro) ermöglichen eine Unterscheidung zwischen den BVDV-Genotypen. BVDV-1 reagiert mit beiden Antikörpern, während Typ 2 BVD-Viren nur mit WB103/105 eine positive Reaktion zeigen.

Geräte und Reagenzien

• Zellkulturflaschen (z.B. TC12,5, TC25)
• Pipetten
• Zellkulturplatten (6-, 24-, 48-, 96-well)
• Sterile Plastikspitzen
• Empfängliche Ziellinien, vorzugsweise KOP-R, MDBK, Klu, (Zeltbank des FLI) oder primäre bovine Zellkulturen
• Spezifische monoklonale Antikörper gegen BVDV bzw. Pestiviren (z.B. c.c.pro)
• FITC-markiertes anti-BVD-Konjugat (z.B. BioX, c.c.pro)
• Peroxidasemarkierte (POD) bzw. Fluoresceinisothiocyanatmarkierte (FITC) Anti-Maus-Antikörper (z.B. Sigma, DAKO)
• Waschpuffer, Substrat/Chromogenlösung (Rezeptur siehe Anhang)
• Standardmäßige Laborausstattung für ein Viruslabor (Sterilwerkbank, Umkehrmikroskop, CO₂-Schrank (37 °C), Zentrifuge, Inkubator (80 °C), Kühlschrank, Kühltruhe (-20 °C, -70 °C).

Puffer

Fluoreszenzerhaltungspuffer (DABCO):

2,5 g 1,4-Diazobicyclo[2,2,2]-octan (DABCO)
in 90 ml Glycerol lösen (37 °C, Wasserbad)
+ 10 ml PBS
pH mit HCI konz. auf 8,6 einstellen

für rote Kernfärbung: zu 100 ml Fluoreszenzpuffer 100 μl Propidiumiodid-Stammlösung (2 mg/ml) zugeben.

16.3.1.2 Antigennachweis mittels ELISA

Für den Antigennachweis werden amtlich zugelassene ELISA-Testkits nach Herstellerangaben unter Berücksichtigung der diagnostischen Lücke eingesetzt. Der jeweils aktuelle Stand zugelassener Mittel ist der Homepage des FLI zu entnehmen. http://www.fli.bund.de/fileadmin/dam_uploads/zulassungsstelle/deutsch/02_d_Zul_Mittel.pdf

16.3.1.3 Antigennachweis mittels Indirekter Immunfluoreszenz

Hautstanzen (vorzugsweise mindestens 6 mm Ø) werden in flüssigem Stickstoff oder in auf ca. -70 °C herabgekühltem n-Heptan schockgefrostet und bei -70 °C gelagert.

Etwa 5 μm dicke Kryostatschnitte werden luftgetrocknet (ca. 30 min). Die Fixierung erfolgt in auf ca. -20 °C vorgekühltem Azeton für 15 bis 20 min bei ca. -20 °C.

Fixierte Kryostatschnitte können mehrere Monate bei ca. -20 °C gelagert werden. In einem Prüfansatz werden bearbeitet:

1. Schnitte von verdächtigen Organproben,
2. Schnitte von Organproben eines BVDV-freien Rindes (= negative Kontrollen),
3. Schnitte eines BVDV-positiven Rindes (= positive Kontrollen).

In jedem Prüfansatz kommen zur Anwendung:

1. Anti-Pestivirus-mAk (z.B. WB 103/105, c.c.pro)
2. Irrelevanter mAk

Protokoll

Alle folgenden Schritte erfolgen bei RT.

• Waschen der fixierten Kryostatschnitte in PBS für 5 min
• Blockierung mit 5 % bovinem Serumalbumin (BSA) in PBS für 30 min
• Kurz waschen in PBS
• Inkubation mit mAk in vom Hersteller empfohlener Arbeitsverdünnung in PBS für 60 min
• Waschen in PBS: 3 x 5 min
• Inkubation (mit FITC-Anti-Maus-Konjugat) in empfohlener Arbeitsverdünnung für 60 min:
  Verdünnung in PBS und Zusatz des Kontrastfarbstoffes Evans blue (3 Teile Konjugat-Arbeitsverdünnung + 1 Teil 0,005 % Evans blue in PBS)
• Waschen in PBS: 3 x 5 min
• Waschen in A.dest. für mindestens 5 min
• Lufttrocknung
• Eindecken der noch leicht feuchten Schnitte mit PBS-Glycerol-Gemisch (1 Teil PBS + 9 Teile Glycerol) oder DABCOFluoreszenzerhaltungs-Puffer

Mikroskopische Beurteilung der Schnitte

Für die mikroskopische Beurteilung der Schnitte ist ein aufrechtes Mikroskop mit Auflichtfluoreszenz (Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe HBO 100 W erforderlich.

Die Beurteilung der Schnitte erfolgt im Vergleich mit den negativen und positiven Kontrollschnitten. Pestivirusantigenpositive Zellen zeigen zytoplasmatische, weitgehend homogene, leuchtende hellgrüne Fluoreszenz. Die Zellkerne bleiben dunkel ausgespart. Virusantigen findet sich in Keratinozyten der Epidermis, im Haarfollikelepithel, in Haarmatrixzellen der Haarzwiebel sowie in der dermalen Haarpapille.

16.3.1.4 Antigennachweis mittels Durchflusszytometrie

Der Virusnachweis mittels Durchflusszytometrie wird nur noch in wenigen Laboren angewandt. Es sind laborintern validierte Protokolle zu verwenden.

16.3.1.5 Virusgenomnachweis mittels RT-PCR

Für den Nachweis von BVD-Virusgenom werden amtlich zugelassene Testkits nach Herstellerangaben und Vorgaben der amtlichen Methodensammlung eingesetzt. Der aktuelle Stand zugelassener Mittel ist der Homepage des FLI zu entnehmen. http://www.fli.bund.de/fileadmin/dam_uploads/zulassungsstelle/deutsch/02_d_Zul_Mittel.pdf

Die Nukleinextraktion ist in der Regel nicht Gegenstand der Zulassung, es sei denn, sie ist integrierter Bestandteil des Testkits. Gleiches trifft auf die Schnelllyse von Ohrstanzproben zu.

Für eine Ermittlung der absoluten Genomlast in der Probe stellt das FLI einen Standard (Dlsyn) zur Verfügung. Auf der Grundlage der Bestimmung der Kopienzahl ist eine Abschätzung des Status (PI, Nicht-PI) des positiv getesteten Tieres weitestgehend möglich. Bei Kopienzahlen von > 10^4/well in Serum und Ohrstanzproben nach RNA-Extraktion bzw. > 10^3,5/well nach Schnelllyse von Ohrstanzproben besteht eine hinreichende Sicherheit für das Vorliegen eines PI-Status.

Die Verwendung validierter in house Protokolle ist möglich, wenn sie den Bedingungen für eine Ausnahmegenehmigung nach § 17c des Tierseuchengesetzes entsprechen und eine entsprechende Genehmigung durch die beauftragte Behörde erteilt wurde. Gegenwärtig trifft das für konventionelle PCR-Protokolle, z.B. mit dem Ziel der nachfolgenden Sequenzierung und für genotypdifferenzierende Protokolle zu.

Protokolle für eine subtypenspezifische BVD-RT-PCR und eine vom AVID zur Anwendung empfohlene genotypdifferenzierende real time RT-PCR sind im Folgenden aufgeführt:

Genotypspezifische RT-PCR (n. Strebelow)

RNA-Isolierung

Die RNA-Isolierung erfolgt üblicherweise durch chromatographische Trennung an Silica-Oberflächen. Dafür sind in Abhängigkeit von der Probenart verschiedene kommerziell erhältliche Kits verwendbar.

One-Tube-RT-PCR

Reagenzien:

1. Super Script^TMIIIOne-Step RT-PCR with Platinum Taq (in-vitrogen)
2. Primer (siehe unten)
3. Mineralöl (Sigma)
4. Rnasefreies Wasser

Ansatz:

Ansatz mit 20 μl Öl überschichten

Auswertung und Validierung

Die Auswertung der RT-PCR erfolgt durch Analyse der PCR-Produkte mittels Agarosegelelektrophorese. Die Spezifität positiver Reaktionen wird durch anschließende Direktsequenzierung der PCR-Fragmente überprüft.

Referenz:

Scharrschmidt, U.; Schirrmeier, H.; Strebelow, G. und Wolf, G. (2000): Nachweis von Border Disease Virus in einem Schafbestand in Sachsen. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 113, 284 - 288

Real time RT-PCR (n. Gaede, AVID-Methode, Auszug)

Allgemeines

Für den Virusnachweis ohne Speziesdifferenzierung werden Primer und eine Sonde mit panpesti-Spezifität eingesetzt. Positive Resultate werden auch für KSPV und BDV erzielt.

Der spezifische Nachweis einer Infektion mit BVDV 2 ist mit Hilfe einer speziesspezifischen Sonde in Kombination mit einem weiteren panpesti-Primerpaar möglich. Ein analoges spezifisches System für BVDV 1 existiert nicht. Die Sonde PPV reagiert zwar negativ auf BVDV 2, detektiert aber neben BVDV 1 auch BDV und KSPV. Indirekt ist die spezifische Bestätigung des Vorliegens von BVDV 1 nur durch den Ausschluss von BVDV 2, BDV und ggf. KSPV mit für diese Virusspezies spezifischen Sonden möglich.

RNA-Isolierung

Die RNA-Isolierung erfolgt üblicherweise durch chromatographische Trennung an Silica-Oberflächen. Dafür sind in Abhängigkeit von der Probenart verschiedene kommerziell erhältliche Kits verwendbar.

Ansatz der RT-PCR

Die hier beschriebenen Parameter gelten für die Verwendung des Quantitect Probe RT-PCR Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) auf dem Mx3000 (Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande) und iCycler (Biorad, Hercules, USA). Bei Verwendung anderer Geräte-Systeme für die realtime PCR kann eine Anpassung erforderlich werden, insbesondere wenn diese Geräte nicht im üblichen 96er Blockformat arbeiten. Die Eignung anderer Enzymkits ist im Bedarfsfall zu prüfen.

• O.I.E. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (2012, Part 2, Section 2.4, Chapter 2.4.13; Stand 2010).

Reaktionsgemisch (20 μl):

• 10 μl Quanti Tect 2 x Probe RT-Mastermix,
• 0,2 μl Quanti Tect RT,
• 1,0 μl forwardprimer (Gebrauchslösung: 10 pmol/μl),
• 1,0 μl reversedprimer (Gebrauchslösung: 10 pmol/μl),
• 1,0 μl Sonde (Gebrauchslösung: 4 pmol/μl **** und
• 2 μl RNA-Template.

Thermocycler-Programm für onestep RT-PCR:

• reverse Transkription: 50 °C, 30 min,
• Denaturierung und Aktivierung der Taq-Polymerase: 95 °C, 15 min,
• 45 Zyklen: Denaturierung bei 94 °C für 20 sek und Annealing/Primer-Extension bei 60 °C für 1 min,
• Messung der Fluoreszenz zum Ende der Annealingphase (FAM-Filter).

Tabelle 1: Primer für die BVDV realtime RT-PCR

Tabelle 2: TaqMan-Sonden für den simultanen Nachweis von BVDV 1 und BVDV 2 sowie zur Differenzierung von BVDV 1 und BVDV 2

Referenz:
GAEDE, W., REITING, R., SCHIRRMEIER; H., DEPNER, K.R., BEER, M. (2005):

Nachweis und Speziesspezifische Differenzierung von Pestiviren mit der realtime RT-PCR. Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr. 118, 113 - 120 bzw. AVID Methodensammlung

16.3.2 Indirekter Erregernachweis

16.3.2.1 Neutralisationstest

Prinzip

Der Test basiert auf einer in vitro Neutralisation einer definierten Virusmenge durch spezifische (neutralisierende) Antikörper in Seren. Durch logarithmische Verdünnung der Seren wird der neutralisierende Antikörpertiter bestimmt. Die Visualisierung der Testergebnisse erfolgt mittels Immunfluoreszenz bzw. Immunperoxydasetest.

Testdurchführung Probenaufarbeitung

Der Neutralisationstest wird mit Serum durchgeführt. Nur in Ausnahmefällen, wenn kein Serum zur Verfügung steht oder wenn spezielle Fragestellungen zu beantworten sind, kann der Test auch mit Plasma durchgeführt werden. Dann ist aber ein höherer Grenztiter (~ 1:20) anzusetzen.

Serum wird aus Blutproben ohne gerinnungshemmenden Zusatz gewonnen. Für die Verwendung im Neutralisationstest werden die Seren für 30 min bei 56 °C inaktiviert.

Plasma wird aus Blutproben mit gerinnungshemmenden Zusätzen gewonnen.

Verdünnungsreihen

Der Der Test wird in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte unter Verwendung von Zellkulturmedium mit Antibiotikazusatz (siehe Anhang) durchgeführt.

Es wird eine Serumverdünnungsreihe in 2er-Stufen (z.B. von 1:5 bis 1:640) mit je einem Volumen von 50 μl pro Kavität hergestellt. Pro Serumverdünnungsstufe werden zwei oder vier Kavitäten (Doppelansatz, bzw. Vierfachansatz) nebeneinander beschickt. Ein Beispiel für eine Plattenbelegung ist w. u. gezeigt.

In die Kavitäten der ersten Vertiefungsreihe werden 80 μl, in die Kavitäten der anderen Reihen 50
μ l Kulturmedium vorgelegt. Zur ersten Vertiefungsreihe wird dann 20 μl Serumprobe zugegeben. Mit einer Multikanalpipette werden aus der ersten Verdünnungsstufe (1:5 Verdünnung) 50 μl aufgenommen, in die nächste Reihe gegeben, durchmischt, und die Verdünnungsreihe fortgesetzt (8 bzw. 12 Verdünnungsstufen). Die letzten 50 μl werden verworfen. Jede Kavität enthält jetzt 50 μl einer Serum-Medium-Verdünnung.

Mindestens zwei positive Referenzseren (BVD-refl oder 2 für BVD1-AK; BVD-ref3 für BVD2-AK; Herkunft: BVDV-NRL, FLI Insel Riems) werden in gleicher Weise als Kontrollen mitgeführt (positive Serumkontrollen).

Testvirus

In jede Kavität werden danach 50 μl mit 100 KID₅₀ der Testvirussuspension gegeben. Die Testvirussuspension muss unmittelbar vor Gebrauch mit Kulturmedium auf 100 KID₅₀/50 μl (2.000 KID₅₀/ml) eingestellt werden. Die benötigte Menge an Testvirus (ca. 5 ml pro Mikrotiterplatte) ist in einem Ansatz herzustellen. Der Verdünnungsfaktor um die Testvirussuspension auf 100 KID₅₀/50 μl einzustellen wird rechnerisch ermittelt. Ein Rechenbeispiel ist w. u. zu finden.

Kontrollen

Neben den positiven Serumkontrollen werden eine Zellkontrolle (100 μl Kulturmedium ohne Serum und Virus), je zu testendes Serum eine virusfreie Serumkontrolle (Grundverdünnung), eine Viruskontrolle und eine Rücktitration des Testvirus zur Bestimmung der eingesetzten KID₅₀ mitgeführt. Mit der Rücktitration kontrolliert man den tatsächlichen Virusgehalt im Test. Hierbei wird die im Test eingesetzte Virusverdünnung in log-2-Schritten beginnend bei 1:10 bis 1:1280 ausverdünnt. 180 μl Kulturmedium werden vorgelegt, 20 μl Testvirussuspension dazugegeben (= 1:10) und anschließend ausverdünnt. Pro Verdünnungsstufe werden zwei oder vier Kavitäten nebeneinander mit 100 μl Virusverdünnung beschickt.

Neutralisation

Die Mikrotiterplatte inkubiert daraufhin für 2 Stunden bei 37 °C in einer feuchten Umgebung in einem CO₂-Schrank (2,5 bzw. 5 % CO₂). Während dieser Zeit findet der Neutralisationsprozess statt.

Zellsuspension

Nach der Inkubationszeit werden in jede Kavität 100 μl der entsprechenden Zellsuspension hinzugefügt. Die Zelldichte muss so eingestellt sein, dass nach 24 Stunden ein konfluenter Zellrasen entsteht. (ca. 300.000 Zellen/ml). Die Mikrotiterplatte verbleibt für 72 h zur Inkubation bei 37 °C in einer feuchten Umgebung im CO₂-Schrank (2,5 bzw. 5 % CO₂).

Immunreaktion

Grundsätzlich, d. h. auch bei Verwendung eines zytopathogenen NT-Virus sollte die Auswertung des Testes nach Detektion des Virus mittels Immunfluoreszenz- bzw. Immunperoxydasetest nach 3 Tagen erfolgen.

Die Berechnung des Antikörpertiters erfolgt als ND50 nach Behrens und Kaerber.

Neutralisationstiter = V- d (S - 0,5)

V: lg der ersten 100 % pos. Serumverdünnung

d: lg des Verdünnungsfaktors (0,3)

S: Summe der pos. Reagenten von 0 bis 100 % Reagentenzahl je Verdünnung Geräte und Reagenzien

• Mikrotiterplatten (96-well)
• Mehrkanalpipetten, Pipetten, sterile Plastikspitzen
• Empfängliche Zellkulturen, z.B.: MDBK, KOP-R, (Zeltbank des FLI)
• Zellkulturmedien
• Referenzviren, BVD 1: NADL; BVD 2: CS8644, (Virusbank des FLI)
• monoklonale Antikörper gegen Pestiviren (z.B. c.c.pro)
• Peroxidasemarkierte Anti-Maus-Antikörper (z.B. Sigma)
• Positiv- und Negativreferenzen
• Standardmäßige Laborausstattung für ein Viruslabor (Sterilwerkbank, Umkehrmikroskop, CO2-Schrank (37 °C), Zentrifuge, Wärmeschrank (80 °C), Kühlschrank, Kühltruhe (-20 °C, -70 °C).
• Referenzseren: NRL BVD, FLI Insel Riems
• Antibiotikalösung
  1,25 g Penicillin
  2 g Streptomycin
  In 20 ml sterilem Aqua bidest lösen, portionieren und bei -20 °C einfrieren oder
  Gentamycin, 1 μl/ml Kulturmedium (50 ng/ml)
  Amphotericin, 10μl/ml

Rechenbeispiel zur Berechnung des Verdünnungsfaktors für das Testvirus

Die im Neutralisationstest zum Einsatz kommende Virussuspension (Testvirus) soll einen Titer von 100 KID₅₀/50 μl haben. Folglich muss das Ausgangsvirus entsprechend verdünnt werden. Die Berechnung des Verdünnungsfaktors erfolgt nach der Formel:

Titer log₁₀ KID₅₀/0,1 ml Ausgangsvirus minus 10^2,3* = log₁₀ Virusverdünnung; entlogarithmieren

Reziproker Wert = Virusverdünnung C 10^2,3 = 200 KID₅₀ pro 0,1 ml)

Beispiel:

Der Titer des Ausgangsvirus beträgt 10^6,3 KID₅₀/ml. Das sind 10^5,3 KID₅₀/0,1 ml.

Berechnung: 10^5,3 - 10^2,3 = 10³

Entlogarithmierung 3,0 1og₁₀ = 1.000

→ Das Ausgangsvirus muss 1:1.000 in Kulturmedium verdünnt werden.

Plattenbelegungsschema:

16.3.2.2 Antikörper-ELISA

Für den Nachweis von BVD-Antikörper werden amtlich zugelassene Testkits nach Herstellerangaben und Vorgaben der amtlichen Methodensammlung eingesetzt. Der aktuelle Stand zugelassener Mittel ist der Homepage des FLI zu entnehmen. http://www.fli.bund.de/fileadmin/dam_uploads/zulassungsstelle/deutsch/02_d_Zul_Mittel.pdf

****) Die optimale Konzentration der Sonde kann variieren und muss ggf. überprüft werden.

ENDE