umwelt-online: Richtlinie 2006/56/EG zur Änderung der Anhänge der RL 93/85/EWG zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (3)
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2. Vorbereitung des Beladungspuffers
2.1. Bromphenolblau (10 %-Stammlösung)
| Bromphenolblau | 5 g |
| Destilliertes Wasser (bidest) | 50 ml |
2.2. Beladungspuffer
| Glyzerin (86 %) | 3,5 ml |
| Bromphenolblau (5,1) | 300 µl |
| Destilliertes Wasser (bidest) | 6,2 ml |
3. 10x Tris-Acetat-EDTA-Puffer (TAE), pH 8,0
| Tris-Puffer | 48,40 g |
| Eisessig | 11,42 ml |
| EDTa (Dinatriumsalz) | 3,72 g |
| Destilliertes Wasser | 1,00 1 |
Vor Gebrauch auf 1 x verdünnen.
Auch im Handel erhältlich (z.B. Invitrogen oder gleichwertiges Produkt).
| Validierte Reagenzien für den FISH-Test | Anlage 7 |
1. Oligo-Sonden
| Cms-spezifische Sonde CMS-CY3-01: | 5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3' |
| Eubakterielle Universalsonde EUB-338-FITC: | 5' gct gcc tcc cgt agg agt-3' |
2. Fixierlösung
[ACHTUNG! FIXATTV ENTHALT TOXISCHES PARAFORMALDEHYD. HANDSCHUHE TRAGEN UND NICHT EIN-ATMEN. ES WIRD EMPFOHLEN, UNTER DEM ABZUG ZU ARBEITEN.]
[ACHTUNG! IN PARAFORMALDEHYD-LÖSUNGEN KEIN PH- MESSGERÄT VERWENDEN.]
Alternative Fixierlösung: 96 %iges Ethanol.
3. 3x Hybmix
| NaCl | 2,7M |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTa (filtersterilisiert und autoklaviert) | 15 mM |
Verdünnen auf 1 x Hybmix vor Gebrauch.
4. Hybridisierungslösung
1 x Hybmix
| Natrium-Dodecylsulfat (SDS) | 0,01% |
| EUB-338-Sonde | 5 ng/µl |
| CMSCY301-Sonde | 5 ng/µl |
Zubereitung der Hybridisierungslösung in den nach Tabelle 1 berechneten Mengen. Für jeden Objektträger (mit 2 duplizierten unterschiedlichen Proben) sind 90 µl Hybridisierungslösung erforderlich.
Tabelle: Empfohlene Mengen für die Zubereitung der Hybridisierungsmischung
| 2 Objektfrager | 8 Objektfrager | |
| Steriles UPW | 50,1 | 200,4 |
| 3x Hybmix | 30,0 | 120,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 |
| EUB-338-Sonde (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |
| CMSCY301-Sonde (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 |
| Gesamtvolumen (μl) | 90,0 | 360,0 |
Anmerkung: Alle Lösungen mit den lichtempfindlichen Oligo-Sonden bei - 20 °C im Dunkeln lagern. Wahrend des Gebrauchs vor direktem Sonnenlicht und künstlichem Licht schützen.
5. 0,1M Phosphatpuffer, pH 7,0
| Na2HPO4 | 8,52 g |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Destilliertes Wasser | 1,00 l |
Substanzen auflösen, den pH-Wert prüfen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.
| Auberginenkultivierung | Anlage 8 |
Auberginensamen (Solanum melongena) in pasteurisierte Anzuchterde säen. Sämlinge mit voll entfalteten Keimblättern (nach 10 bis 14 Tagen) in pasteurisierte topferde umsetzen.
Auberginen in einem Gewächshaus anziehen, das die folgenden Umweltbedingungen erfüllt:
| Tageslänge: | 14 Stunden oder natürliche Tageslänge, wenn länger. | |
| Temperatur. | tagsüber. | 21 bis 24 °C, |
| nachts: | 15 °C. |
| Anfällige Auberginensorten: | "Black Beauty",
"Long Tom", "Rima", "Balsas". |
Lieferant: siehe Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
| Gram-Färbungsverfahren (modifiziert nach Hucker) (Doetsch, 1981) 1 | Anlage 9 |
Kristallviolett-Lösung
2 g Kristallviolett in 20 ml 95 %igem Ethanol auflösen.
(Stand: 11.03.2019)
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