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C.4-E. VI.1. Prinzip der Methode

Die Lösung der Prüfsubstanz im mineralischen Medium, normalerweise in einer Konzentration von 2-5 mg/l, wird mit einer relativ kleinen Anzahl Mikroorganismen einer gemischten Population beimpft und in vollständig gefüllten, verschlossenen Flaschen im Dunkeln bei konstanter Temperatur gehalten. Der Abbau wird 28 Tage lang mittels Analyse des gelösten Sauerstoffs verfolgt. Die von der Prüfsubstanz verbrauchte Sauerstoffmenge, korrigiert um die Aufnahme im parallelen Inokulum-Blindversuch, wird als Prozent des ThSB oder CSB angegeben.

C.4-E. VI.2. Beschreibung der Methode

C.4-E. VI.2.1. Geräte

1. BSB-Flaschen mit Glasstopfen, z.B. 250-300 ml;
2. Wasserbad oder Inkubator, in dem die Flaschen im Dunkeln bei konstanter Temperatur (± 1 °C oder genauer) gehalten werden;
3. Große Glasflaschen (2-5 l) zur Vorbereitung der Medien und zum Füllen der BSB-Flaschen;
4. Sauerstoffelektrode und -meßgerät bzw. Ausrüstung und Reagenzien zur Winkler-Titration.

C.4-E. VI.2.2. Ansatz des mineralischen Mediums

Zubereitung der Stammlösungen siehe I.6.2.

1 ml der Lösungen (a) bis (d) zusammengeben und mit Verdünnungswasser auf 1 l auffüllen.

C.4-E. VI.2.3. Ansatz des Inokulums

Das Inokulum ist normalerweise von Abläufen einer Kläranlage oder Anlagen im Labormaßstab, denen vorwiegend häusliche Abwässer zugeleitet werden, zu entnehmen. Alternativ kann ein Inokulum aus Oberflächengewässern verwendet werden. Die Verwendung sollte üblicherweise ein Tropfen (0,05 ml) bis 5 ml Filtrat pro Liter Medium betragen; Versuche können erforderlich werden, um das geeignete Volumen für den jeweiligen Ablauf zu ermitteln. (Vgl. I.6.4.2. und I.6.5.).

C.4-E. VI.2.4. Ansatz der Flaschen

Das mineralische Medium ist über mindestens 20 min intensiv zu belüften. Jede Prüfreihe ist mit mineralischem Medium aus derselben Charge durchzuführen. Im allgemeinen ist das Medium nach 20 h-Stehen bei der Prüftemperatur gebrauchsfertig. Für Kontrollzwecke ist die Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu bestimmen; der Wert sollte bei 20 °C etwa 9 mg/l betragen. Alle Transfer- und Fülloperationen mit luftgesättigtem Medium sind blasenfrei auszuführen, z.B. durch Verwendung von Ansaughebern.

Gruppen von Flaschen zur gleichzeitigen BSB-Bestimmung der Prüf- und Referenzsubstanz werden in parallelen Versuchsreihen angesetzt. Eine ausreichende Anzahl von BSB-Flaschen - einschließlich der für die Inokulum-Blindversuche - ist so aufzustellen, daß zu den gewünschten Zeitpunkten, z.B. nach 0, 7, 14, 21 und 28 Tagen, mindestens Doppelmessungen des Sauerstoffverbrauchs vorgenommen werden können. Wenn das 10-Tage-Fenster erkannt werden soll, können mehr Flaschen erforderlich sein.

Die großen Flaschen werden zu etwa einem Drittel ihres Volumens mit vollständig belüftetem mineralischem Medium gefüllt. Danach wird soviel an Stammlösungen der Prüf- sowie der Referenzsubstanz in getrennte Flaschen gegeben, daß die Endkonzentration der Substanzen im Normalfall nicht größer als 10 mg/l ist. Der Blindkontrolle werden in einer anderen großen Flasche keine chemischen Substanzen hinzugesetzt.

Um sicherzustellen, daß die Aktivität des Inokulums nicht eingeschränkt wird, darf die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in den BSB-Flaschen nicht unter 0,5 mg/l fallen. Dies beschränkt die Konzentration der Prüfsubstanz auf etwa 2 mg/l. Für schwer abbaubare Substanzen und solche mit einem geringen ThSB können jedoch 5-10 mg/l verwendet werden. In einigen Fällen kann es ratsam sein, parallele Versuchsreihen mit der Prüfsubstanz in zwei verschiedenen Konzentrationen, z.B. 2 und 5 mg/l, anzusetzen. Normalerweise ist der ThSB auf der Grundlage der Bildung von Ammoniumsalzen zu berechnen; wenn aber eine Nitrifikation erwartet oder vorausgesetzt werden kann, muß die Berechnung auf der Basis der Nitratbildung erfolgen (ThSB_NO3: siehe Anhang II.2.). Bei auftretender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, muß eine Korrektur erfolgen, die die Veränderungen der analytisch ermittelten Nitrit- und Nitratkonzentration berücksichtigt (Anhang V).

Wenn die Toxizität der Prüfsubstanz bestimmt werden soll (z.B. im Falle einer zuvor ermittelten geringen biologischen Abbaubarkeit), ist eine zusätzliche Reihe Flaschen notwendig.

Eine weitere große Flasche ist mit belüftetem mineralischem Medium (etwa bis zu einem Drittel ihres Volumens) mit Prüf- und Referenzsubstanz zusammen anzusetzen, in Endkonzentrationen wie normalerweise in den anderen großen Flaschen.

Die Lösungen in den großen Flaschen sind mit dem Ablauf aus einer Kläranlage (ein Tropfen oder etwa 0,05 ml auf 5 ml/l) oder mit einem Inokulum anderer Herkunft, z.B. Flußwasser, zu beimpfen (vgl. I.6.4.2.). Schließlich werden die Lösungen mit Hilfe eines Schlauches, der bis zum Boden der Flasche reicht, mit belüftetem mineralischem Medium aufgefüllt, um eine ausreichende Durchmischung zu gewährleisten.

C.4-E. VI.2.5. Anzahl der Flaschen in einem typischen Ansatz

In einem typischen Ansatz werden folgende Flaschen benötigt:

mindestens 10 Flaschen mit Prüfsubstanz und Inokulum (Prüfsuspension),

mindestens 10 Flaschen nur mit Inokulum (Inokulum-Blindwert),

mindestens 10 Flaschen mit Referenzsubstanz und Inokulum (Verfahrenskontrolle),

sowie, falls erforderlich, 6 Flaschen mit der Prüf-, der Referenzsubstanz und dem Inokulum (Toxizitätskontrolle). Um jedoch sicherzustellen, das 10-Tage-Fenster zu erkennen, ist etwa die doppelte Anzahl Flaschen erforderlich.

C.4-E. VI.2.6. Durchführung der Prüfung

Jede zubereitete Lösung wird sofort mit einem Schlauch aus dem unteren Viertel (nicht vom Flaschenboden) der entsprechenden großen Flasche auf die jeweilige Gruppe von BSB-Flaschen verteilt, bis alle BSB-Flaschen vollständig gefüllt sind. Danach wird leicht an die Flaschen geklopft, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Die Flaschen zum Zeitpunkt 0 werden sofort nach dem Winkler- oder dem Elektrodenverfahren auf gelösten Sauerstoff analysiert. Der Inhalt der Flaschen kann zwecks späterer Analyse durch Zugabe von Mangan-(II)-sulfat und Natronlauge (dem ersten Winkler-Reagens) konserviert werden. Die sorgfältig mit einem Stopfen verschlossenen Flaschen, die den fixierten Sauerstoff als braunes Mangan-(III)1oxihydrat enthalten, sind im Dunkeln bei 10-20 °C nicht länger als 24 h aufzubewahren, bevor mit dem Winkler-Verfahren fortgefahren wird. Die verbleibenden parallelen Flaschen werden mit einem Stopfen versehen, wobei darauf zu achten ist, daß keine Luftblasen in den Flaschen eingeschlossen werden, und bei 20 °C im Dunkeln inkubiert. Neben jeder Versuchsreihe führt man eine vollständige Parallelreihe zur Bestimmung des Inokulum-Blindwertes mit. Während der 28-tägigen Inkubation sind in bestimmten Zeitabständen (mindestens einmal wöchentlich) mindestens zwei Flaschen pro Serie zwecks Untersuchung auf gelösten Sauerstoff zu entnehmen.

Die wöchentlichen Proben gestatten die Bewertung der prozentualen Abnahme in einem 14-Tage-Fenster, während die Probenahme alle 3-4 Tage die Bestimmung des 10-Tage-Fensters ermöglichen soll, wofür jedoch etwa die doppelte Anzahl von Flaschen erforderlich ist.

Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen sind Korrekturen für die Sauerstoffaufnahme infolge Nitrifikation vorzunehmen. Dazu ist die O₂-Elektrodenmethode zur Bestimmung der Konzentration von gelöstem Sauerstoff zu verwenden und anschließend zwecks Nitrit- und Nitratanalyse eine Probe aus der BSB-Flasche zu entnehmen. Aus der Zunahme der Nitrit- und Nitratkonzentration ist der Sauerstoffverbrauch zu berechnen (siehe Anhang V).

C.4-E. VI.3. Daten und Abschlußbericht

C.4-E. VI.3.1. Auswertung der Ergebnisse

Zuerst ist der BSB nach jedem Zeitabschnitt zu berechnen; dazu ist die O₂-Eigenzehrung (mg O2/l) des Inokulum-Blindansatzes von dem Wert des Prüfansatzes zu subtrahieren. Diese korrigierte Zehrung ist durch die Konzentration (mg/l) der Prüfsubstanz zu dividieren, um so den spezifischen BSB, ausgedrückt als mg Sauerstoff pro mg Prüfsubstanz, zu erhalten. Die prozentuale biologische Abbaubarkeit wird dann durch Dividieren des spezifischen BSB durch den spezifischen ThSB (bestimmt entsprechend Anhang II.2) oder CSB (bestimmt durch Analyse, vgl. Anhang II.3) wie folgt berechnet:

oder

Dabei ist anzumerken, daß diese beiden Verfahren nicht notwendigerweise denselben Wert ergeben; vorzugsweise sollte das erste Verfahren verwendet werden.

Bei stickstoffhaltigen Prüfsubstanzen ist, je nachdem ob eine Nitrifikation zu erwarten ist oder nicht (Anhang II.2), der entsprechende ThSB-Wert (NH₄ oder NO₃) zu verwenden. Bei stattfindender, jedoch unvollständiger Nitrifikation, ist aus den Veränderungen der Nitrit- und Nitratkonzentration ein Korrekturfaktor für den durch die Nitrifikation verbrauchten Sauerstoff zu berechnen (Anhang V).

C.4-E. VI.3.2. Gültigkeit der Ergebnisse

Bei der Impfzehrkontrolle sollte der Sauerstoffverbrauch nach 28 Tagen 1,5 mg gelösten Sauerstoff pro Liter nicht überschreiten. Bei höheren Werten ist eine Überprüfung der Versuchsdurchführung vorzunehmen. Die in den Prüfflaschen verbleibende Sauerstoffkonzentration darf zu keinem Zeitpunkt 0,5 mg/l unterschreiten. Solch niedrige Sauerstoffkonzentrationen sind nur gültig, wenn das zur Bestimmung des gelösten Sauerstoffs verwendete Verfahren in der Lage ist, solche Konzentrationen genau zu messen.

Vgl. auch I.5.2.

C.4-E. VI.3.3. Abschlußbericht

Vgl. I.8.

C.4-E. VI.4. Datenblatt

Nachstehend ein Beispiel eines Datenblattes

Geschlossener Flaschentest

1. Labor
2. Datum bei Versuchsbeginn
3. Prüfsubstanz

   Name:

   Konzentration der Stammlösung: ... mg/l

   Anfangskonzentration in der Flasche: ... mg/l

   ThSB bzw. CSB: ... mg O2/mg Prüfsubstanz

4. Inokulum

   Herkunft: ...

   Vorgenommene Behandlung: ...

   Vorbereitung/Konditionierung (falls zutreffend): ...

   Konzentration im Reaktionsgemisch: ... ml/l

5. DO-Bestimmung

   Methode: Winkler- oder Elektrodenverfahren

   Flaschenanalyse

   Inkubationszeit			DO (mg/l)
   			o	n1	n2
   Blindwert (ohne Prüfsubstanz)	1	C1
   	2	C2
   Mittelwert	mb=(C1+C2)/2
   Prüfsubstanz	1	a1
   	2	a2
   Mittelwert	Mt=(a1+a2)/2

   Anmerkung: Für die Referenzsubstanz sowie Toxizitätskontrolle können ähnliche Formblätter verwendet werden.

6. Korrektur infolge Nitrifikation (vgl. Anhang V)
   

   Tag	0	n1	n2	n3
   (i) Nitritkonzentration (mg N/l)
   (ii) Änderung der Nitratkonzentration (mg N/l)	-
   (iii) Sauerstoffäquivalent (mg N/l)	-
   (iv) Nitrikonzentration (mg N/l)
   (v) Änderung der Nitritkonzentration (mg N/l)	-
   (vi) Sauerstoffäquivalent (mg/l)	-
   (iii + vi) Sauerstoffäquivalent insges. (mg/l)	-

7. DO-Zehrung: % Abbau
   

   	n1	n2	n3
   Flasche 1: (mt0 - mtx) - (mb0 - mbx)
   Flasche 2: (mt0 - mtx) - (mb0 - mbx)
   Flasche 1: [(mt0 - mtx) - (mb0 - mbx)] ξ 100 % D1= Prüfkonz. ξ ThSB Prüfsubst.
   Flasche 2: [(mt0 - mtx) - (mb0 - mbx)] ξ 100 % D2= Prüfkonz. ξ ThSB Prüfsubst.
   % D Mittelwert* = (D1+D2) / 2
   * Nicht mittteln bei starker Abweichung der Parallelansätze

   
   

   mt0 = Wert in der Prüfflasche zur Zeit 0

   mtx = Wert in der Prüfflasche zur Zeit x

   mb0 = Mittelwert Blindansatz zur Zeit 0

   mbx = Mittelwert Blindansatz zur Zeit x

   Außerdem ist die Korrektur infolge Nitrifikation aus iii+iv in Abschnitt 6 vorzunehmen.

8. DO-Zehrung im Inokulum-Blindansatz

   Sauerstoffverbrauch im Blindversuch: (m_b0 - m_b28) mg/l. Dieser Verbrauch ist wichtig für die Gültigkeit des Tests. Er sollte unter 1,5 mg/l liegen.

weiter .