umwelt-online: Bestimmung der Toxizität

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B.36.1. Methode

B.36.1.1. Einleitung

Siehe allgemeine Einleitung Teil B.

B.36.1.2. Definitionen

Siehe allgemeine Einleitung Teil B.

B.36.1.3. Bezugssubstanzen

Keine.

B.36.1.4. Prinzip der Methode

Die Prüfsubstanz wird auf einem geeigneten Weg verabreicht. Je nach Zweck der Untersuchung kann die Substanz einmalig oder in bestimmten Zeitabständen wiederholter Dosierung einer oder mehreren Gruppen von Versuchstieren verabreicht werden. Anschließend werden je nach Art der Untersuchung die Substanz und/oder ihre Metaboliten in den Körperflüssigkeiten, Gewebe und/oder Ausscheidungen bestimmt.

Die Untersuchungen können mit "unmarkierter" oder "markierter" Prüfsubstanz erfolgen. Wird eine radioaktive Markierung verwendet, sollte sie in der Substanz in der Form enthalten sein, daß sie möglichst viele Informationen über das Schicksal der Verbindung liefert.

B.36.1.5. Qualitätskriterien

Keine.

B.36.1.6. Beschreibung der Methode

Vorbereitung

Gesunde, junge, ausgewachsene Tiere werden mindestens 5 Tage vor dem Versuch an die Laborbedingungen akklimatisiert. Vor Beginn des Versuches werden die Tiere randomisiert und in Behandlungsgruppen eingeteilt. Für bestimmte Fragestellungen können sehr junge, trächtige oder vorbehandelte Tiere verwendet werden.

Versuchsbedingungen

Versuchstiere

Toxikokinetische Untersuchungen können an einer oder mehreren geeigneten Tierarten durchgeführt werden. Hierbei ist zu berücksichtigen, ob diese Tierarten in anderen toxikologischen Untersuchungen mit der gleichen Substanz verwendet wurden oder verwendet werden sollen. Dienen Nager als Versuchstiere, sollten die Gewichtsschwankungen ± 20 % vom Durchschnittsgewicht nicht überschreiten.

Anzahl und Geschlecht

Für die Untersuchungen zu Absorption und Exkretion sollte jede Dosierungsgruppe zu Beginn 4 Tiere umfassen. Eine geschlechtsspezifische Auswahl ist nicht erforderlich, doch kann es unter bestimmten Umständen notwendig sein, beide Geschlechter zu untersuchen. Treten geschlechtsspezifische Unterschiede auf, sollten vier Tiere beider Geschlechter untersucht werden. Bei Untersuchungen an Nicht-Nagern reicht auch eine geringere Anzahl von Tieren aus.

Für die Untersuchung zur Verteilung sollten bei der Festlegung der anfänglichen Gruppengröße sowohl die Anzahl der zu den verschiedenen Untersuchungszeitpunkten zu tötenden Tiere als auch die Anzahl der Untersuchungszeitpunkte berücksichtigt werden.

Für die Untersuchung zum Metabolismus ist die Zahl der Tiere pro Gruppe entsprechend .zu erhöhen.

Bei Untersuchungen mit mehreren Dosierungen und mehreren Untersuchungszeitpunkten sind bei der Festlegung der Zahl der Tiere die Anzahl der Untersuchungszeitpunkte und geplanten Tötungen zu berücksichtigen. Jede Gruppe pro Zeitpunkt der Untersuchung muß jedoch aus mindestens 2 Tieren bestehen. Die Zahl der Tiere sollte ausreichen, um hinlängliche Informationen über Aufnahme, Plateau und Abnahme (je nach Bedarf) der Prüfsubstanz und/oder ihrer Metaboliten zu liefern.

Dosierungen

Bei einmaliger Verabreichung sind mindestens zwei Dosierungen zu wählen: eine niedrige Dosierung, bei der keine toxischen Wirkungen zu beobachten sind und eine hohe Dosierung, bei der Veränderung der toxikokinetischen Parameter auftreten können oder bei der eine toxische Wirkung eintritt.

Bei mehrmaliger Verabreichung reicht die niedrige Dosis normalerweise aus, doch kann unter bestimmten Umständen auch eine hohe Dosis erforderlich sein.

Verabreichungsweg

Bei den toxikokinetischen Untersuchungen ist der gleiche Verabreichungsweg und ggf. das gleiche Vehikel zu verwenden wie bei anderen schon durchgeführten oder geplanten Toxizitätsuntersuchungen. Die Prüfsubstanz wird im allgemeinen den Versuchstieren in festgelegten Zeiträumen oral mit einer Magensonde oder im Futter, durch Inhalation oder dermal verabreicht. Die intravenöse Verabreichung der Prüfsubstanz kann zur Bestimmung der relativen Absorptionsrate bei einer anderen Applikationsroute sinnvoll sein. Außerdem lassen sich bald nach der intravenösen Verabreichung einer Prüfsubstanz Informationen über das Verteilungsmuster ermitteln.

Die Möglichkeit einer Interferenz zwischen Vehikel und Prüfsubstanz ist zu berücksichtigen. Es ist darauf zu achten, ob die Absorptionsrate bei Verabreichung der Prüfsubstanz mit der Magensonde Unterschiede im Vergleich zur Verabreichung im Futter aufweist und daß die Dosis genau bestimmt wird, vor allem bei Verabreichung der Prüfsubstanz im Futter. Die Dosierung - vor allem bei Verabreichung der Prüfsubstanz im Futter - muß genau bestimmt werden können.

Beobachtungszeitraum

Alle Tiere sind täglich zu beobachten; Zeichen von Toxizität sowie relevante klinische Beobachtungen und deren Beginn, Ausmaß und Dauer sind aufzuzeichnen.

Verfahren

Nach Feststellen des Körpergewichtes der Versuchstiere wird die Prüfsubstanz auf geeignetem Wege verabreicht. Falls erforderlich, sollten die Tiere die Prüfsubstanz nüchtern erhalten.

Absorption

Geschwindigkeit und Ausmaß der Absorption der verabreichten Substanz lassen sich mit verschiedenen Methoden mit und ohne Referenzgruppen ¹ bestimmen, z.B. durch:

• Bestimmung der Menge der Prüfsubstanz und/oder ihrer Metabotiten in den Exkreten, z.B. im Urin, Gallenflüssigkeit, Faezes, Atemluft sowie im Körper der getöteten Tiere;
• Vergleich der biologischen Wirkung (z.B. Untersuchungen zur akuten Toxizität) bei Versuchs und Kontroll- und/oder Referenzgruppen;
• Vergleich der über die Nieren ausgeschiedenen Substanz und/oder ihrer Metaboliten bei Versuchs. und Referenzgruppen;
• Bestimmung der Fläche unter der Plasma- Spiegel- Kurve der Prüfsubstanz und/oder ihrer Metaboliten und deren Vergleich mit Daten von Referenzgruppen
• Verteilung
• Zur Analyse der Verteilungsmuster stehen derzeit zwei Möglichkeiten zur Verfügung, die einzeln oder gemeinsam eingesetzt werden können:
• qualitative Informationen liefern Ganzkörper- Autoradiographieverfahren;
• quantitative Informationen erhält man durch Tötung der Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Exposition und Bestimmung von Konzentration und Menge der Prüfsubstanz und/oder ihrer Stoffwechselprodukte in Geweben und Organen.

Exkretion

Bei den Exkretionsuntersuchungen werden Urin, Faezes und Atemluft und - unter bestimmten Umständen - Gallenflüssigkeit gesammelt. Die Menge der Prüfsubstanz und/oder ihrer Stoffwechselprodukte in diesen

Ausscheidungen ist zu verschiedenen Zeiten nach der Exposition zumessen, bis etwa 95 % der verabreichten Dosis ausgeschieden wurde (höchstens jedoch sieben Tage lang).

In besonderen Fällen kann es notwendig sein, auch die Exkretion der Prüfsubstanz in der Milch säugender Versuchstiere zu berücksichtigen.

Stoffwechsel

Zur Bestimmung von Stoffwechselintensität und - muster sind biologische Proben durch geeignete Verfahren zu analysieren. Wenn sich aus vorangegangenen toxikologischen Untersuchungen Fragen ergeben, dann sind Strukturen von Metaboliten zu klären und entsprechende Stoffwechselwege aufzuzeigen. In vitro- Untersuchungen können sich zur Ermittlung von Informationen über Stoffwechselwege als nützlich erweisen.

Weitere Angaben über die Beziehung zwischen Stoffwechsel und Toxizität können biochemische Untersuchungen liefern, z.B. die Bestimmung der Beeinflussung metabolisierender Enzymsysteme, die Abnahme endogener Nicht- Eiweißartiger- Sulphydryl- Verbindungen und die Bindung der Substanz an Makromoleküle.

B.36.2. Daten

Je nach Art der durchgeführten Untersuchung sind die Daten in tabellarischer Form, ggf. ergänzt durch graphische Darstellungen, zusammenzufassen. Soweit sinnvoll, sind für jede Versuchsgruppe die durchschnittlichen und statistischen Schwankungen in Relation zu Zeit, Dosierung, Gewebe und Organen anzugeben. Absorptionsrate und Ausscheidungsmenge und - Geschwindigkeit sind durch geeignete Verfahren zu bestimmen. Bei Stoffwechseluntersuchungen ist die Struktur der ermittelten Metaboliten anzugeben; mögliche Sroffwechselwege sind aufzuzeichnen.

B.36.3. Abschlußbericht

B.36.3.1. Prüfbericht

Im Prüfbericht ist, wenn möglich, folgendes anzugeben:

• Tierarten, Tierstamm, Herkunft, Haltungsbedingungen, Fütterung;
• Merkmale der markierten Stoffe, sofern verwendet;
• Dosierungen und zeitliche Abstände zwischen den Verabreichungen;
• Verabreichungsweg(e) und evtl. verwendete Vehikel;
• toxische und andere beobachtete Wirkungen;
• Verfahren zur Bestimmung der Prüfsubstanz und/oder ihrer Stoffwechselprodukte in biologischen Proben einschließlich Atemluft;
• tabellarische Darstellung der Messungen nach Geschlecht, Dosierung, Futter, Zeit, Geweben und Organen;
• Angaben über Absorptionsrate und Exkretion über die Zeit;
• Verfahren zur Beschreibung und Identifizierung von Stoffwechselprodukten in biologischen Proben;
• Verfahren für biologische Stoffwechselmessungen;
• vorgeschlagene Stoffwechselwege;
• Diskussion der Ergebnisse;
• Bewertung der Ergebnisse.

B.36.3.2. Interpretation

Siehe allgemeine Einleitung Teil B; G

B.36.4. Literaturhinweise

Siehe allgemeine Einleitung Teil B; H

weiter .

1) Bei der Referenzgruppe handelt es sich um eine Gruppe, der die Prüfsubstanz auf einem anderen Wege verabreicht wird und die die vollständige Verfügbarkeit der Dosis gewährleistet.