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A. Einleitung

Siehe allgemeine Einleitung.

B. Allgemeine Definitionen der in den Testmethoden in diesem Anhang verwendeten Begriffe

1. Akute Toxizität umfaßt die schädigenden Wirkungen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums (gewöhnlich 14 Tage) nach Verabreichung einer Einzeldosis einer Substanz auftreten.
2. Offensichtliche Toxizität ist ein allgemeiner Begriff zur Beschreibung deutlicher Toxizitätszeichen nach Verabreichung einer Prüfsubstanz. Diese Zeichen sollten für eine Bewertung der Gefährdung ausreichen und so schwerwiegend sein, daß bei einer Steigerung der verabreichten Dosis die Entwicklung schwerer Toxizitätszeichen und der wahrscheinliche Tod zu erwarten wären.
3. Dosis ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Gewicht (Gramm oder Milligramm) oder als Gewicht der Prüfsubstanz pro Gewichtseinheit des Versuchstieres (z.B. mg/kg Körpergewicht) oder als konstante Futterkonzentration (parts per million oder mg/kg Futter) angegeben.
4. Höchste nicht letale Dosis ("discriminating dose") ist die höchste von vier festgesetzten Dosisstufen, die verabreicht werden kann, ohne daß eine substanzbedingte Mortalität eintritt (einschließlich vorzeitiger Tötungen aus Tierschutzgründen).
5. Dosierung ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, die Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung einschließt.
6. LD₅₀ (mittlere Letaldosis) ist eine statistisch errechnete Einzeldosis einer Substanz, die voraussichtlich bei 50 % der exponierten Tiere zum Tode führt. Der LD₅₀-Wert wird als Gewicht der Prüfsubstanz pro Gewichtseinheit des Versuchstieres (mg/kg Körpergewicht) angegeben.
7. LC₅₀ (mittlere Letalkonzentration) ist eine statistisch errechnete Konzentration einer Substanz, die voraussichtlich bei 50 % der für eine bestimmte Zeit exponierten Tiere während der Exposition oder innerhalb eines bestimmten Zeitraums danach zum Tode führt. Der LC₅₀-Wert wird als Gewicht der Prüfsubstanz pro Standardluftvolumen (mg/l) angegeben.
8. NOAEL ist die Abkürzung für "no observed adverse effect level" und entspricht der höchsten Dosis oder Expositionskonzentration, bei der keine schädigenden behandlungsbedingten Befunde beobachtet werden.
9. Toxizität bei wiederholter Gabe/subchronische Toxizität umfaßt die schädigenden Wirkungen, die bei Versuchstieren als Ergebnis wiederholter täglicher Verabreichung oder Exposition gegenüber einer chemischen Substanz auftreten. Die Behandlungsdauer erstreckt sich über eine kurze Zeit im Verhältnis zur speziesspezifischen Lebenszeit.
10. Maximal verträgliche Dosis (maximum tolerated dose, MTD) ist die höchste Dosis, die bei Tieren Anzeichen einer Toxizität verursacht, ohne jedoch wesentliche Auswirkungen auf die Überlebenszeit der Tiere während der jeweiligen Testdauer zu zeigen.
11. Unter Hautreizung ist das Auslösen entzündlicher Veränderungen in der Haut nach Applikation einer Prüfsubstanz zu verstehen.
12. Unter Augenreizung ist das Auslösen von Veränderungen am Auge nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des Auges zu verstehen.
13. Hautsensibilisierung (allergische Kontaktdermatitis) ist eine immunologisch vermittelte Hautreaktion auf eine Prüfsubstanz.
14. Unter Hautverätzung ist das Auslösen einer irreversiblen Gewebeschädigung in der Haut nach Applikation einer Prüfsubstanz für die Dauer von 3 Minuten bis zu vier Stunden zu verstehen.
15. Toxikokinetik umfaßt Untersuchungen zu Resorption, Verteilung, Stoffwechsel und Ausscheidung von Prüfsubstanzen.
16. Resorption ist der Vorgang, durch den eine verabreichte Substanz in den Körper aufgenommen wird.
17. Ausscheidung ist der Vorgang, durch den die verabreichte Substanz und/oder ihre Stoffwechselprodukte aus dem Körper ausgeschieden werden.
18. Verteilung ist der Vorgang, durch den die resorbierte Substanz und/oder ihre Stoffwechselprodukte im Körper verteilt werden.
19. Stoffwechsel ist der Vorgang, durch den die verabreichte Substanz im Körper durch enzymatische oder nichtenzymatische Reaktionen in ihrer Struktur umgebaut wird.

B.I. Akute Toxizität, Toxizität bei wiederholter Gabe/subchronische Toxizität und chronische Toxizität

Die akuten toxischen Wirkungen sowie die Organ- oder Systemtoxizität einer Substanz kann anhand einer Reihe von Toxizitätsprüfungen (Methoden B.1 - B.5) bewertet werden, die nach einer Einzeldosis erste Rückschlüsse auf die Toxizität zulassen.

Je nach Toxizität der Substanz kann ein Limit-Test oder ein kompletter LD₅₀-Test in Erwägung gezogen werden, auch wenn in Untersuchungen zur Inhalationstoxizität kein Limit-Test angegeben wird, da es nicht möglich war, einen einheitlichen Expositionsgrenzwert für die Inhalation festzulegen.

In Betracht gezogen werden sollten stets Methoden, die möglichst wenig Tiere benötigen und das Leiden der Tiere auf ein Minimum beschränken, wie zum Beispiel die Fest-Dosis-Methode (Methode B.1bis) und die akute toxische Klasse (Methode B.1.tris). In Prüfungen der Stufe 1 kann eine Untersuchung an einer zweiten Spezies die aus der ersten Untersuchung gezogenen Schlußfolgerungen ergänzen. In diesem Fall kann eine Standardprüfmethode verwendet werden, oder die Methode kann für eine kleinere Anzahl von Tieren angepaßt werden.

Die Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Gabe (Methoden B.7, B.8 und B.9) bewertet die toxischen Wirkungen bei wiederholter Exposition. Hierbei ist die Notwendigkeit einer sorgfältigen klinischen Beobachtung der Tiere zu unterstreichen, um möglichst viele Daten zu gewinnen. Diese Prüfungen sollten dazu beitragen, die Zielorgane der toxischen Wirkungen sowie die toxischen und nichttoxischen Dosen zu ermitteln. Weitere eingehende Untersuchungen dieser Aspekte können in den Langzeitstudien erforderlich sein (Methoden B.26 - B.30 und B.33).

B.II. Mutagenität, Gentoxizität

Mutagenität bezeichnet die Induktion permanenter vererbbarer Veränderungen in Menge oder Struktur des genetischen Materials von Zellen oder Organismen. Diese Veränderungen, sogenannte "Mutationen", können ein einzelnes Gen oder Gensegmente, einen Genblock oder ganze Chromosomen betreffen. Die Wirkungen auf ganze Chromosomen können struktureller und/oder numerischer Art sein.

Die mutagene Wirkung einer Substanz wird durch In-vitro-Tests auf Gen-(Punkt-) Mutationen in Bakterien (Methode B.13/14) und/oder auf strukturelle Chromosomenaberrationen in Säugetierzellen (Methode B.10) bewertet.

Akzeptabel sind auch In-vivo-Verfahren, z.B. der Mikronukleus-Test (Methode B.12) oder die Metaphasenanalyse von Knochenmarkzellen (Methode B.11). Allerdings sind, sofern keine besonderen Gründe dagegen sprechen, die In-vitro-Methoden unbedingt vorzuziehen.

Zusätzliche Prüfverfahren zur weiteren Untersuchung der Mutagenität oder als Vorab-Screening auf Karzinogenität können für höhere Produktionsvolumina und/oder zur Durchführung oder Nachbeobachtung einer Risikobewertung erforderlich sein. Diese können folgenden Zwecken dienen: Bestätigung von Ergebnissen aus Untersuchungen der Grundstufe, Untersuchung von Endpunkten, die in der Grundstufe nicht erfaßt wurden, und Durchführung erster oder vertiefender In-vivo-Untersuchungen.

Für diese Zwecke umfassen die Methoden B.15 bis B.25 eukaryote In-vivo- und In-vitro-Systeme sowie eine größere Zahl biologischer Endpunkte. Diese Prüfungen geben Aufschluß über Punktmutationen und weitere Endpunkte in Organismen, die komplexer sind als die in den Untersuchungen der Grundstufe verwendeten Bakterien.

Als allgemeines Prinzip gilt: Ein Programm zur weiteren Untersuchung der Mutagenität ist so aufzubauen, daß die Prüfungen zusätzliche relevante Informationen über das mutagene und/oder karzinogene Potential des jeweiligen Stoffes liefern.

Welche Untersuchungen jeweils in einem spezifischen Fall geeignet sind, hängt von zahlreichen Faktoren ab, z.B. den chemischen und physikalischen Eigenschaften des Stoffes, den Ergebnissen der ersten bakteriellen und zytogenetischen Untersuchungen, dem Stoffwechselprofil der Substanz, den Ergebnissen anderer Toxizitätsprüfungen und den bekannten Verwendungszwecken des Stoffes. Ein starres Schema für die Auswahl der Prüfungen ist daher angesichts der Vielzahl der unter Umständen zu berücksichtigenden Faktoren nicht zweckmäßig.

Einige allgemeine Grundsätze für die Prüfstrategie sind in der Richtlinie 93/67/EWG niedergelegt; klare Prüfvorgaben finden sich hingegen in den technischen Leitlinien zur Risikobewertung, die jedoch flexibel gehandhabt und nach Bedarf den jeweiligen Umständen angepaßt werden können.

Die Methoden für weiterführende Untersuchungen sind im folgenden nach ihrem wichtigsten genetischen Endpunkt gruppiert:

Prüfungen zur Untersuchung von Gen-(Punkt-)Mutationen

1. Vorwärts- oder Rückmutationstests unter Verwendung eukaryoter Mikroorganismen (Saccharomyces cerevisiae) (Methode B.15)
2. In-vitro-Tests zur Untersuchung von Vorwärtsmutationen in Säugetierzellen (Methode B.17)
3. Tests auf geschlechtsgebundene rezessive Letalmutationen in Drosophila melanogaster (Methode B.20)
4. In-vivo-Tests auf somatische Mutationen: Maus-Fellfleckentest (Methode B.24)

Prüfungen zur Untersuchung von Chromosomenaberrationen

1. Zytogenetische In-vivo-Tests an Säugetieren; die In-vivo-Metaphasenanalyse von Knochenmarkzellen sollte in Betracht gezogen werden, wenn sie nicht bereits im Rahmen der ersten Prüfungen durchgeführt wurde (Methode B.11). Außerdem können Keimzellen in vivo zytogenetisch untersucht werden (Methode B.23).
2. Zytogenetische In-vitro-Tests an Säugetierzellen, soweit sie nicht bereits im Rahmen der ersten Prüfungen durchgeführt wurden (Methode B.10).
3. Dominant-Letal-Test bei Nagern (Methode B.22).
4. Tests auf vererbbare Translokationen bei der Maus (Methode B.25).

Gentoxische Wirkungen - Wirkungen auf die DNS

Die Gentoxizität, die gekennzeichnet ist durch mögliche schädliche Wirkungen auf genetisches Material, die nicht notwendigerweise mit einer Mutagenität verbunden sind, kann durch eine induzierte Schädigung der DNS ohne direkte Belege für Mutationen angezeigt werden. Die folgenden Methoden auf der Basis von eukaryoten Mikroorganismen oder Säugetierzellen können für eine entsprechende Untersuchung geeignet sein:

1. Mitotische Rekombination in Saccharomyces cerevisiae (Methode B.16)
2. DNS-Schädigung und -Reparatur - außerplanmäßige DNS-Synthese - an Säugetierzellen in vitro (Methode B.18)
3. Schwesterchromatidaustausch in Säugetierzellen in vitro (Methode B.19)

Alternative Methoden zur Untersuchung des karzinogenen Potentials

Es stehen Zelltransformationstests zur Verfügung, die die Fähigkeit eines Stoffes messen, morphologische und verhaltensbedingte Veränderungen in Säugerzellkulturen auszulösen, die vermutlich mit malignen Transformationen in vivo verbunden sind (Methode B.21). Dazu lassen sich eine Reihe verschiedener Zelltypen und Transformationskriterien verwenden.

Bewertung des Risikos für erbliche Wirkungen in Säugetieren

Es stehen Verfahren zur Verfügung, um beim Säuger in vivo vererbbare Schäden, die durch Gen-(Punkt-)Mutationen bedingt sind, zu untersuchen, z.B. der spezifische Genlocustest bei der Maus zur Erkennung von Keimzellmutationen in der ersten Generation (nicht in diesem Anhang enthalten), oder für Chromosomenaberrationen, z.B. der Test auf vererbbare Translokationen bei der Maus (Methode B.25). Solche Verfahren können zur Abschätzung des potentiellen genetischen Risikos eines Stoffes für den Menschen herangezogen werden. Allerdings müssen angesichts der Komplexität dieser Prüfverfahren und der dazu benötigten sehr großen Anzahl an Versuchstieren - was insbesondere für den spezifischen Genlocustest bei der Maus gilt - gute Gründe für die Durchführung dieser Prüfungen vorliegen.

B.III. Karzinogenität

Chemische Stoffe lassen sich, je nach dem vermuteten Wirkungsmechanismus, als gentoxische oder nicht gentoxische Karzinogene bezeichnen.

Erste Anhaltspunkte auf ein gentoxisches karzinogenes Potential einer Substanz lassen sich aus den Mutagenitäts-/Gentoxizitätstests ableiten. Weitere Hinweise ergeben sich aus den Toxizitätsprüfungen bei wiederholter Gabe sowie den Prüfungen auf subchronische oder chronische Toxizität. Die Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Gabe (Methode B.7) und Langzeitprüfungen bei wiederholter Gabe beinhalten die Untersuchung auf histopathologische Veränderungen, z.B. Hyperplasien in bestimmten Geweben, die von Bedeutung sein könnten. Diese Untersuchungen und toxikokinetische Daten können dazu beitragen, chemische Stoffe mit karzinogenem Potential aufzuspüren, die gegebenenfalls weitere eingehende Untersuchungen dieses Aspektes im Rahmen einer Prüfung auf Karzinogenität (Methode B.32) oder häufig im Rahmen einer kombinierten Prüfung auf chronische Toxizität/Karzinogenität (Methode B.33) erfordern.

B.IV. Reproduktionstoxizität

Die Reproduktionstoxizität läßt sich auf verschiedene Weise ermitteln, wie z.B. aufgrund einer Beeinträchtigung der männlichen und weiblichen Fortpflanzungsfunktionen bzw. -fähigkeit, d. h. also anhand der "Wirkungen auf die Fertilität", oder aufgrund der Induktion nicht vererbbarer schädigender Wirkungen auf die Nachkommen, d. h. also anhand der "Entwicklungstoxizität", wobei teratogene Wirkungen sowie Wirkungen während der Laktation ebenfalls einbezogen sind.

Bei Teratogenitätsuntersuchungen im Rahmen der Prüfung auf Entwicklungstoxizität ist die Prüfmethode (Methode B.31) in erster Linie auf die orale Verabreichung ausgelegt. Alternativ dazu können, je nach den physikalischen Eigenschaften der Prüfsubstanz oder dem wahrscheinlichen Expositionsweg beim Menschen, auch andere Verabreichungswege untersucht werden. In diesen Fällen sollte die Prüfmethode unter Berücksichtigung der jeweiligen Kriterien des 28-Tage-Tests entsprechend angepaßt werden.

Ist ein Drei-Generationen-Reproduktionstest (Fertilität) erforderlich, kann das für den Zwei-Generationen-Reproduktionstest beschriebene Verfahren (Methode B.35) auf eine dritte Generation ausgeweitet werden.

B.V. Neurotoxizität

Die Neurotoxizität läßt sich auf verschiedene Arten nachweisen, wie z.B. funktionelle Veränderungen und/oder biochemische Veränderungen im zentralen oder peripheren Nervensystem. Erste Hinweise auf eine Neurotoxizität sind den Prüfungen auf akute Toxizität zu entnehmen. Die Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Gabe (Methode B.7) beinhaltet die Untersuchung auf neurotoxikologische Wirkungen, wobei die Notwendigkeit einer sorgfältigen klinischen Beobachtung der Tiere zu unterstreichen ist, um möglichst viele Daten zu gewinnen. Die Methode sollte dazu beitragen, chemische Stoffe mit neurotoxischem Potential aufzuspüren, die dann gegebenenfalls eine eingehendere Untersuchung dieses Aspektes erfordern. Darüber hinaus gilt es aber auch, das Potential von Substanzen, spezifische neurotoxische Wirkungen hervorzurufen, die in anderen Toxizitätsprüfungen möglicherweise nicht erfaßt werden, zu untersuchen. Bestimmte phosphororganische Verbindungen zum Beispiel können zu einer verzögerten Neutrotoxizität führen; sie können anhand der Methoden B.37 und B.38 nach Einzelgabe oder wiederholter Gabe untersucht werden.

B.VI. Immuntoxizität

Die Immuntoxizität läßt sich auf verschiedene Arten nachweisen, wie z.B. durch Immunsuppression und/oder Steigerung der Ansprechbarkeit des Immunsystems mit resultierender Überempfindlichkeit oder induzierter Autoimmunität. Die Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Gabe (Methode B.7) beinhaltet die Untersuchung auf immuntoxische Wirkungen. Die Methode sollte dazu beitragen, chemische Stoffe mit immuntoxischem Potential aufzuspüren, die dann gegebenenfalls eine eingehendere Untersuchung dieses Aspektes erfordern.

B.VII. Toxikokinetik

Toxikokinetische Untersuchungen sind für die Interpretation und Bewertung von Toxizitätsdaten hilfreich. Mit diesen Untersuchungen sollen bestimmte Aspekte der Toxizität der zu prüfenden chemischen Substanz geklärt werden. Die Ergebnisse können die Planung weiterer Toxizitätsuntersuchungen erleichtern. Es ist nicht vorgesehen, daß in jedem Fall sämtliche Parameter bestimmt werden müssen. Nur in seltenen Fällen ist das gesamte Repertoire der toxikokinetischen Untersuchungen (Resorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung) erforderlich. Bei bestimmten Verbindungen sind u. U. Änderungen dieser Reihenfolge ratsam; auch kann eine Prüfung mit nur einer Dosierung ausreichend sein (Methode B.36).

Informationen über die chemische Struktur (SAR) und physikalisch-chemische Eigenschaften können ebenfalls Rückschlüsse auf die Resorptionseigenschaften beim vorgesehenen Verabreichungsweg sowie auf die Stoffwechselvorgänge und die Verteilung in den Geweben zulassen. Auch aus vorangegangenen toxikologischen und toxikokinetischen Untersuchungen liegen möglicherweise Informationen über toxikokinetische Parameter vor.

C. Charakterisierung der Prüfsubstanz

Die Zusammensetzung der Prüfsubstanz, einschließlich der Hauptverunreinigungen, ihre relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften sowie die Stabilität der Substanz müssen vor Beginn einer Toxizitätsuntersuchung bekannt sein.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz sind mitentscheidend für die Auswahl des Verabreichungsweges, die Art der einzelnen Prüfungen sowie für die Handhabung und Lagerung der Prüfsubstanz.

Der eigentlichen Untersuchung sollte daher die Entwicklung eines Analyseverfahrens zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Prüfsubstanz (möglichst einschließlich der Hauptverunreinigungen) im Verabreichungsmedium und im biologischen Material vorausgehen.

Alle Angaben bezüglich der Identifikation, der physikalisch-chemischen Eigenschaften, der Reinheit und des Verhaltens der Prüfsubstanz sollten im Prüfbericht enthalten sein.

D. Tierpflege

Eine strenge Kontrolle der Umweltbedingungen sowie eine den jeweiligen Tierarten angemessene Tierhaltung sind wesentliche Voraussetzungen für toxikologische Untersuchungen.

(i) Haltungsbedingungen

Die Umgebungsbedingungen in den Versuchstierräumen sind der jeweiligen Tierart anzupassen. Für Ratten, Mäuse und Meerschweinchen ist eine Raumtemperatur von 22 °C ± 3 °C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30-70 % angezeigt; bei Kaninchen sollte die Temperatur 20 °C ± 3 °C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30-70 % betragen.

Einige Untersuchungsmethoden sind besonders empfindlich gegenüber Temperatureinflüssen. Für diese Fälle sind Einzelheiten über die entsprechenden Umgebungsbedingungen in der Beschreibung des Prüfverfahrens enthalten. Bei allen Untersuchungen auf toxische Wirkungen sind Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu überwachen, aufzuzeichnen und in den Abschlußbericht der Untersuchung aufzunehmen.

Die Beleuchtung sollte künstlich sein und die Hell- und Dunkelphasen sollten sich im Abstand von 12 Stunden abwechseln. Einzelheiten des Beleuchtungsmusters sind aufzuzeichnen und in den Abschlußbericht der Studie aufzunehmen.

Sofern in der Beschreibung der Prüfmethode nichts anderes angegeben ist, sollten die Tiere einzeln oder in kleinen Gruppen aus Tieren desselben Geschlechts in Käfigen untergebracht sein. Bei Gruppenhaltung sollten maximal fünf Tiere in einem Käfig untergebracht sein.

In Berichten über Tierversuche ist unbedingt die Art der Käfighaltung sowie die Anzahl der in einem Käfig untergebrachten Tiere sowohl während der Exposition gegenüber der Prüfsubstanz als auch während der darauf folgenden Beobachtungszeit anzugeben.

(ii) Fütterungsbedingungen

Das Futter muß allen ernährungswissenschaftlichen Anforderungen für die jeweils eingesetzte Spezies entsprechen. Werden den Tieren Prüfsubstanzen im Futter verabreicht, so kann der Nährwert durch Wechselwirkung zwischen der jeweiligen Substanz und einem Futterbestandteil eingeschränkt sein. Die Möglichkeit einer solchen Reaktion muß bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Es kann herkömmliches Labortierfutter verwendet werden bei uneingeschränkter Versorgung mit Trinkwasser. Die Auswahl des Futters kann auch dadurch mitbestimmt werden, daß eine geeignete Beimischung der Prüfsubstanz gewährleistet sein muß, wenn die Prüfsubstanz auf diese Art verabreicht werden soll.

Verunreinigungen im Futter, die sich nachweislich auf die Toxizität auswirken, dürfen nicht in störenden Konzentrationen vorhanden sein.

E. Schutz der Tiere

Bei der Erarbeitung der Prüfverfahren wurde der Tierschutz in angemessener Weise berücksichtigt. Im folgenden werden einige Beispiele aufgeführt, doch ist die Liste nicht vollständig. Der genaue Wortlaut und/oder die genauen Bedingungen sind der Beschreibung der Prüfmethode zu entnehmen:

• Zur Bestimmung der akuten oralen Toxizität sind zwei alternative Verfahren, die sogenannte "Fest-Dosis-Methode" oder die "Methode der akuten toxischen Klasse" in Betracht zu ziehen. Bei der Fest-Dosis-Methode wird nicht der Tod als spezifischer Endpunkt verwendet und es werden weniger Tiere benötigt. Bei der "Methode der akuten toxischen Klasse" werden im Durchschnitt 70 % weniger Tiere als bei der Methode B.1 zur Bestimmung der akuten oralen Toxizität verwendet. Beide alternativen Verfahren führen zu weniger Schmerzen und Leiden bei den Versuchstieren als die klassischen Methoden.
• Die Anzahl der im Versuch verwendeten Tiere ist auf das wissenschaftlich annehmbare Minimum reduziert; für die Verfahren B.1 und B.3 werden lediglich fünf Tiere identischen Geschlechts pro Dosierung geprüft; für die Bestimmung der Sensibilisierung der Haut durch den Meerschweinchen-Maximierungstest (Methode B.6) werden lediglich 10 Tiere und für die negative Kontrollgruppe nur fünf Tiere benötigt. Die Anzahl der Tiere, die für die positive Kontrollgruppe bei der Prüfung der Mutagenität in vivo eingesetzt werden, wird ebenfalls gesenkt (Methoden B.11 und B.12).
• Die Tiere haben während der Tests weniger Schmerzen und Qualen zu erleiden: Tiere mit schweren und anhaltenden Zeichen von Schmerz können vorzeitig unter Verwendung einer tierschutzgerechten Methode getötet werden; es brauchen keine Versuche mit Substanzdosen durchgeführt zu werden, von denen man weiß, daß sie aufgrund ihrer ätzenden oder reizenden Wirkungen starke Schmerzen oder Qualen verursachen (Methoden B.1, B.2 und B.3).
• Die Prüfung von für diese Versuche nicht relevanten hohen Dosierungen wird durch die Durchführung von Limit-Tests vermieden; dies gilt nicht nur für die Prüfung auf akute Toxizität (Methoden B.1, B.2 und B.3), sondern auch für die In-vivo-Mutagenitätstests (Methoden B.11 und B.12).
• Sofern ausreichende wissenschaftliche Nachweise dafür vorgelegt werden können, kann die Prüfung auf Reizungen gegebenenfalls entfallen bzw. auf eine Untersuchung an einem einzigen Tier beschränkt werden.

Diese wissenschaftlichen Erkenntnisse können sich auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, auf die Ergebnisse bereits durchgeführter anderer Prüfungen oder die Ergebnisse gut validierter In-vitro-Prüfungen stützen. Wenn z.B. eine Prüfung auf akute Toxizität bei dermaler Applikation mit der Limit-Testdosis der Substanz (Methode B.3) durchgeführt und dabei keine Hautreizung beobachtet wurde, kann sich eine weitere Prüfung auf Hautreizungen (Methode B.4) erübrigen. Substanzen, die sich in einer Prüfung auf Hautreizungen (Methode B.4) bereits eindeutig als ätzend oder schwer hautreizend erwiesen haben, sollten nicht weiter auf eine Augenreizwirkung geprüft werden (Methode B.5).

F. Alternative Prüfmethoden

Ein wissenschaftliches Ziel für die Europäische Union ist die Entwicklung und Validierung alternativer Verfahren, welche dieselben Informationen liefern können wie die gegenwärtigen Tierversuche, aber weniger Tiere erfordern, weniger Leiden verursachen oder die Verwendung von Tieren völlig überflüssig machen.

Solche Methoden müssen, sobald sie zur Verfügung stehen, nach Möglichkeit für die Charakterisierung von Gefahren und die anschließende Einstufung und Kennzeichnung im Hinblick auf substanzeigene Gefahren in Betracht gezogen werden.

G. Bewertung und Interpretation

Bei der Auswertung und Interpretation von Tests sind gewisse Grenzen hinsichtlich der direkten Extrapolation der Ergebnisse der Tier- und In-vitro-Versuche auf den Menschen zu berücksichtigen; deshalb können Belege für unerwünschte Wirkungen beim Menschen, soweit solche vorliegen, zur Bestätigung der Versuchsergebnisse herangezogen werden.

Diese Ergebnisse können für die Einstufung und Kennzeichnung neuer und alter chemischer Stoffe bezüglich der Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit verwendet werden; die Grundlage dafür sind ihre charakteristischen Eigenschaften, die mit diesen Methoden identifiziert und quantifiziert werden. Die entsprechenden Kriterien in Anhang VI zur Einstufung und Kennzeichnung beziehen sich auch auf die Endpunkte der Prüfprotokolle dieser Testmethoden.

Diese Ergebnisse können auch für Studien zur Risikoabschätzung neuer und alter chemischer Stoffe genutzt werden, und geeignete Prüfstrategien für diese Zwecke sind in den entsprechenden Leitlinien angegeben.

H. Literaturhinweise

Die meisten dieser Methoden werden im Rahmen des OECD-Programms für Prüfrichtlinien entwickelt und sollten in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der guten Laborpraxis durchgeführt werden, um eine möglichst breite "gegenseitige Datenakzeptanz" zu gewährleisten.

Weitere Informationen finden sich in den in den OECD-Richtlinien genannten Literaturangaben sowie in der an anderen Stellen publizierten einschlägigen Literatur.

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