umwelt-online: Bestimmung der Toxizität

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B. 5.1. Methode

Diese Prüfmethode entspricht der OECD TG 405 (2002).

B. 5.1.1 Einleitung

Bei der Erarbeitung dieser aktualisierten Methode wurde besonderes Augenmerk auf mögliche Verbesserungen durch die Auswertung aller bereits vorhandenen Angaben über den Stoff gelegt, um unnötige Prüfungen an Labortieren zu vermeiden und somit auch Belange des Tierschutzes zu berücksichtigen. Die vorliegende Methode beinhaltet die Empfehlung, vor der Durchführung des beschriebenen In-vivo-Tests zur Ermittlung der akuten Reiz-/Ätzwirkung des Stoffs für die Augen eine kritische Analyse (1) der bereits vorhandenen einschlägigen Daten vorzunehmen. Sofern nicht genügend Daten zur Verfügung stehen, können diese mit Hilfe sequenzieller Tests erzielt werden (2)(3). Die empfohlene Prüfstrategie, die im Anhang zur Prüfmethode dargelegt wird, enthält die Durchführung validierter und anerkannter In-vitro-Tests. Zudem wird empfohlen, einen In-vivo-Test auf Hautreizung/-verätzung durchzuführen, ehe die Möglichkeit eines In-vivo-Augentests in Betracht gezogen wird.

Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes sollen In-vivo-Tests erst dann in Erwägung gezogen werden, wenn alle für das Augenverätzungs/-reizungspotenzial des Stoffs zur Verfügung stehenden einschlägigen Daten im Rahmen einer kritischen Analyse ausgewertet worden sind. Zu diesen Daten gehören unter anderem Erkenntnisse aus bereits durchgeführten Untersuchungen am Menschen und/oder an Labortieren; Hinweise auf Verätzungen/Reizungen durch eine oder mehrere strukturell verwandte Substanzen bzw. Gemische aus diesen Substanzen; Daten, die eine starke Azidität oder Alkalinität der Substanz belegen (4)(5), und Ergebnisse validierter und anerkannter In-vitro- und Exvivo-Tests auf Hautverätzungen und -reizungen (6)(6a). Diese Studien können sowohl bereits vorgelegen haben als auch auf Grund einer kritischen Anaalyse der vorhandenen Daten erstellt worden sein.

Im Hinblick auf bestimmte Substanzen ergibt eine solche Analyse möglicherweise, dass deren Augenverätzungs-/-reizungspotenzial im Rahmen von In-vivo-Studien untersucht werden muss. In all diesen Fällen sollen vorzugsweise zunächst die dermalen Wirkungen der Substanz in einem In-vivo-Test untersucht und in Übereinstimmung mit der Prüfmethode B.4 (7) bewertet werden, bevor ein In-vivo-Augentest in Erwägung gezogen wird. Die kritische Analyse und die sequenzielle Prüfstrategie sollen dazu führen, dass weniger In-vivo-Untersuchungen zum Augenverätzungs-/-reizungspotenzial von Stoffen durchgeführt werden, wenn bereits andere Studien ausreichende Belege geliefert haben. Kann die augenätzende oder -reizende Wirkung auch nach einer In-vivo-Studie der Hautverätzung und -reizung nicht mit Hilfe der sequenziellen Prüfstrategie ermittelt werden, besteht die Möglichkeit, einen In-vivo-Test auf Augenverätzung/-reizung durchzuführen.

Im Anhang zu dieser Methode wird eine bevorzugte sequenzielle Prüfstrategie vorgestellt, welche die Durchführung validierter und anerkannter In-vitro- und Ex-vivo-Tests auf Verätzungs-/Reizungswirkungen einbezieht. Diese Strategie wurde während eines OECD-Workshops (8) entwickelt und von den Teilnehmern einmütig empfohlen. Sie wurde als empfohlene Prüfstrategie für das Globale HarmonisierteSystem der Einstufung und Kennzeichnung Chemischer Stoffe (Globally Harmonised System for the Classification of Chemical Substances = GHS) (9) angenommen. Es wird empfohlen, dass diese sequenzielle Prüfstrategie vor einem In-vivo-Test durchgeführt wird. Bei neuen Substanzen wird sie als stufenweiser Prüfansatz empfohlen, mit dessen Hilfe verlässliche wissenschaftliche Daten über die durch die Prüfsubstanz hervorgerufene Verätzung/Reizung erzielt werden können. Bei bereits bekannten Stoffen, für die nicht genügend Daten zum Hautverätzungs-/-reizungspotenzial bzw. Augenverätzungs-/-reizungspotenzial vorliegen, soll die Strategie genutzt werden, um Datenlücken zu schließen. Der Einsatz einer anderen Prüfstrategie bzw. eines anderen Prüfverfahrens oder die Entscheidung gegen einen stufenweisen Prüfansatz soll gerechtfertigt werden.

B. 5.1.2 Definitionen

Augenreizung: ist das Auslösen von Veränderungen am Auge nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Applikation vollständig reversibel sind.

Augenverätzung: ist das Auslösen einer irreversiblen Gewebeschädigung im Auge oder einer massiven Verschlechterung des Sehvermögens nach Applikation einer Prüfsubstanz auf die Oberfläche des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach Applikation nicht vollständig reversibel sind.

B. 5.1.3 Prinzip der Prüfmethode

Die Prüfsubstanz wird in einer einmaligen Dosierung in ein Auge jedes Versuchstiers eingebracht; das unbehandelte Auge dient als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird bestimmt, indem in zuvor festgelegten Zeitabständen Schädigungen der Bindehaut, der Hornhaut und der Iris anhand einer Punkteskala bewertet werden. Darüber hinaus werden auch andere Reaktionen des Auges und systemische Schäden beschrieben, um die Wirkungen vollständig beurteilen zu können. Die Beobachtungsdauer soll ausreichend sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen.

Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Leiden und/oder Schmerzen können jederzeit während des Versuchs human getötet werden, wobei die Substanz entsprechend einzustufen ist. Kriterien für die humane Tötung moribunder Tiere mit starken Anzeichen von Leiden sind dem Literaturhinweis (10) zu entnehmen.

B. 5.1.4 Beschreibung der Prüfmethode B. 5.1.4.1 Vorbereitung des In-vivo-Tests

B. 5.1.4.1.1 Auswahl der Tierspezies

Das bevorzugte Labortier ist das Albino-Kaninchen, wobei für den Test gesunde junge erwachsene Kaninchen verwendet werden. Die Verwendung anderer Rassen oder Spezies soll begründet werden.

B. 5.1.4.1.2 Vorbereitung der Versuchstiere

24 Stunden vor dem Versuch werden bei jedem der ausgewählten Versuchstiere beide Augen untersucht. Tiere, bei denen bereits eine Augenreizung, okulare Defekte oder eine Schädigung der Cornea vorliegen, sollen nicht verwendet werden.

B. 5.1.4.1.3 Haltungs- und Fütterungsbedingungen

Die Tiere sollen einzeln gehalten werden. Die Temperatur im Versuchstierraum soll 20°C (±3°C) betragen. Obwohl die relative Luftfeuchtigkeit mindestens 30% betragen und zu anderen Zeiten als während der Reinigung vorzugsweise nicht über 70% liegen sollte, ist ein Wert von 50-60% anzustreben. Der Raum soll künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden soll. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist.

B. 5.1.4.2 Prüfverfahren

B. 5.1.4.2.1 Applikation der Prüfsubstanz

Die Prüfsubstanz wird bei jedem Tier in den Bindehautsack eines Auges appliziert, indem man das untere Lid leicht vom Augapfel wegzieht. Die Lider werden dann etwa eine Sekunde lang leicht zusammengedrückt, damit keine Substanz verloren geht. Das andere, unbehandelte Auge dient als Kontrolle.

B. 5.1.4.2.2 Ausspülen

Die Augen der Versuchstiere sollen frühestens 24 Stunden nach Applikation der Prüfsubstanz ausgewaschen werden; Ausnahmen gelten für Feststoffe (siehe Abschnitt 1.4.2.3.2) und bei sofortigem Eintritt von ätzenden oder reizenden Wirkungen. Nach 24 Stunden kann gegebenenfalls eine Augenspülung erfolgen.

Der Einsatz einer zusätzlichen Versuchstiergruppe, an der der Einfluss des Ausspülens untersucht wird, wird nicht empfohlen außer in wissenschaftlich begründeten Fällen. Sollte eine zusätzliche Versuchstiergruppe tatsächlich benötigt werden, so sollen zwei Kaninchen verwendet werden. Die Bedingungen, unter denen die Augenspülung erfolgte, sollen sorgfältig dokumentiert werden, z.B. Zeitpunkt, Zusammensetzung und Temperatur der Spüllösung, Dauer, Volumen und Geschwindigkeit der Applikation.

B. 5.1.4.2.3 Dosierungen

B. 5.1.4.2.3.1 Prüfung von Flüssigkeiten

Bei der Prüfung von Flüssigkeiten wird eine Dosis von 0,1 ml verwendet. Liegt die Prüfsubstanz in Form eines Pumpsprays vor, solle sie nicht direkt ins Auge eingebracht werden, sondern mittels Sprühstoß entnommen und in einem Behälter aufgefangen werden. Anschließend werden 0,1 ml in das Auge eingebracht.

B. 5.1.4.2.3.2 Prüfung von Feststoffen

Bei Feststoffen, Pasten und partikelförmigen Substanzen soll die Prüfmenge ein Volumen von 0,1 ml oder ein Gewicht von höchstens 100 mg haben. Das Prüfmaterial soll zu einem feinem Pulver zermahlen werden. Das Volumen von Feststoffen soll erst nach vorsichtigem Kompaktieren, z.B. durch Klopfen des Messbehälters, bestimmt werden. Ist die in Form eines Feststoffs vorliegende Prüfsubstanz bis zum ersten Beobachtungszeitpunkt, d. h. 1 Stunde nach der Applikation, nicht aufgrund physiologischer Vorgänge aus dem Auge entfernt worden, kann das Auge mit Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser ausgespült werden.

B. 5.1.4.2.3.3 Prüfung von Aerosolen

Es wird empfohlen, alle als Pumpspray oder Aerosol vorliegenden Prüfsubstanzen mittels Sprühstoß zu entnehmen, in einem Behälter aufzufangen und anschließend zu applizieren. Die einzige Ausnahme sind Substanzen in Aerosol-Druckbehältern, die aufgrund der Vaporisierung nicht aufgefangen werden können. In diesen Fällen soll das Auge offen gehalten werden und die Prüfsubstanz mit einem einzigen Sprühstoß etwa eine Sekunde lang aus 10 cm Entfernung vom Auge verabreicht werden. In Abhängigkeit vom Druck und vom Behälterinhalt kann dieser Abstand variieren. Es ist darauf zu achten, dass das Auge durch den Sprühdruck nicht verletzt wird. Unter Umständen muss das Risiko "mechanischer" Augenschäden, die auf den Sprühdruck zurückzuführen sind, beurteilt werden.

Bei Aerosolen kann die Dosis anhand einer Schätzung ermittelt werden, indem der Test folgendermaßen simuliert wird: Die Substanz wird durch eine Öffnung in der Größe eines Kaninchenauges auf Wägepapier gesprüht, wobei sich die Öffnung unmittelbar vor dem Papier befindet. Anhand des Gewichtsanstiegs des Papiers wird ein Näherungswert für die ins Auge gesprühte Menge ermittelt. Bei flüchtigen Stoffen kann ein Schätzwert für die Dosierung ermittelt werden, indem man einen Auffangbehälter vor und nach Entnahme des Prüfmaterials wiegt.

B. 5.1.4.2.4 Vorversuch (In-vivo-Test auf Augenreizung/-verätzung an einem Tier)

Es empfiehlt sich dringend, den In-vivo-Test zunächst nur an einem Tier durchzuführen. Dies entspricht den Anforderungen der sequenziellen Prüfstrategie (siehe Anhang 1).

Sofern das beschriebene Verfahren ergibt, dass der Stoff ätzend auf das Auge wirkt oder schwere Augenreizungen auslöst, sollen keine weiteren Prüfungen auf Augenreizung durchgeführt werden.

B. 5.1.4.2.5 Lokale Anästhetika

Im Einzelfall können lokale Anästhetika eingesetzt werden. Ergibt die kritische Analyse aller bereits vorliegenden Daten, dass die Substanz Schmerzen auslösen kann, oder zeigt der Vorversuch, dass eine Schmerzreaktion auftreten wird, kann vor dem Einträufeln der Prüfsubstanz ein lokales Anästhetikum verabreicht werden. Die Entscheidung über Art, Konzentration und Dosis des lokalen Anästhetikums soll sorgfältig abgewogen werden, um zu gewährleisten, dass keine Abweichungen in der Reaktion auf die Prüfsubstanz auftreten. Das als Kontrolle dienende Auge soll ebenfalls mit dem Anästhetikum behandelt werden.

B. 5.1.4.2.6 Bestätigungstest (In-vivo-Test auf augenreizende Wirkungen an zusätzlichen Tieren)

Wird im Vorversuch keine ätzende Wirkung beobachtet, soll die Reizungsreaktion bzw. die negative Reaktion an bis zu zwei weiteren Tieren bestätigt werden. Ergibt der Vorversuch eine schwere Reizungswirkung, was auf eine möglicherweise schwere (irreversible) Wirkung im Bestätigungstest schließen lässt, soll der Bestätigungstest nach Möglichkeit als sequenzieller Versuch an jeweils einem Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt und nicht durch gleichzeitige Exposition der zwei weiteren Tiere erfolgen. Der Test ist abzubrechen, wenn beim zweiten Tier Anzeichen einer Verätzung oder einer schweren Reizung festgestellt werden. Zur Bestätigung schwacher oder mäßiger Reizungsreaktionen werden unter Umständen zusätzliche Tiere gebraucht.

B. 5.1.4.2.7 Beobachtungszeitraum

Die Beobachtungszeit soll so bemessen sein, dass das Ausmaß und die Reversibilität der festgestellten Wirkungen vollständig bewertet werden kann. Allerdings soll der Versuch abgebrochen werden, sobald das Tier starke und anhaltende Anzeichen von Leiden und Schmerzen zeigt (9). Um feststellen zu können, ob die Wirkungen reversibel sind, sollen die Tiere in der Regel für die Dauer von 21 Tagen nach Applikation der Prüfsubstanz beobachtet werden. Bilden sich die Schäden vor Ablauf dieser 21 Tage zurück, soll der Versuch zu dem betreffenden Zeitpunkt beendet werden.

B. 5.1.4.2.7.1 Klinische Beobachtungen und Bewertung von Augenreaktionen

Die Augen sollen 1, 24, 48 und 72 Stunden nach Aufbringen der Prüfsubstanz untersucht werden. Sobald aussagekräftige Informationen gewonnen worden sind, soll der Versuch nicht länger als nötig fortgesetzt werden. Tiere mit starken und anhaltenden Anzeichen von Schmerzen oder Leiden sollen unverzüglich human getötet werden, wobei die Substanz entsprechend einzustufen ist. Bei Tieren mit folgenden Augenschädigungen nach Applikation der Prüfsubstanz ist eine humane Tötung angezeigt: Hornhautperforation oder signifikante Hornhautulzeration mit Staphylom; Blut in der vorderen Augenkammer; Hornhauttrübung Grad 4, die 48 Stunden bestehen bleibt; fehlender Pupillenreflex (Irisreaktion Grad 2) für die Dauer von 72 Stunden; Ulzeration der Bindehaut; Nekrose der Bindehaut oder der Nickhaut; oder Gewebsdemarkierung. Diese Schäden sind im Allgemeinen irreversibel.

Tiere, bei denen keine Augenschädigungen auftreten, dürfen frühestens 3 Tage nach der Behandlung getötet werden. Bei leichten bis mäßigen Schädigungen sollen die Tiere bis zum Abklingen bzw. für die Dauer von 21 Tagen beobachtet werden. Danach wird die Studie abgeschlossen. Untersuchungen sollen am 7., 14. und 21. Tag erfolgen, um den Status der Schädigungen zu ermitteln und um zu klären, ob sie reversibel oder irreversibel sind.

Der jeweilige Grad der Augenreaktion (Bindehaut, Hornhaut und Iris) soll bei jeder Untersuchung dokumentiert werden (Tabelle I). Auch alle anderen Augenschädigungen (z.B. Pannus, Verfärbungen) oder systemischen Folgen sollen protokolliert werden.

Als Hilfsmittel können bei den Untersuchungen Binokularlupen, Handspaltlampen, Biomikroskope und andere geeignete Geräte benutzt werden. Nach Aufzeichnung der Beobachtungen nach 24 Stunden können die Augen einiger bzw. aller Kaninchen außerdem mit Fluorescein untersucht werden.

Die Bewertung von Augenreaktionen ist zwangsläufig subjektiv. Um die Einstufung von Augenreaktionen stärker zu vereinheitlichen und den Prüflabors und allen an den Versuchen und an der Interpretation der Versuchsergebnisse Beteiligten die Arbeit zu erleichtern, müssen die Prüfer im Umgang mit der Bewertungsskala entsprechend geschult werden.

B. 5.2. Daten

B. 5.2.2 Ergebisbewertung

Die Bewertung der Augenreizung sollte anhand der Art und des Schweregrads der Schädigung und deren Reversibilität bzw. Irreversibilität vorgenommen werden. Die einzelnen ermittelten Schweregrade stellen keinen allein gültigen Maßstab für die reizenden Eigenschaften eines Stoffs dar, denn es werden auch andere Effekte der Prüfsubstanz beurteilt. Vielmehr sollten die einzelnen Graduierungswerte als Referenzwerte betrachtet werden, die nur dann sinnvoll sind, wenn sämtliche Beobachtungen vollständig beschrieben und beurteilt werden.

B. 5.3. Berichterstattung

B. 5.3.1 Prüfbericht

Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten:

Begründung für den In-vivo-Test: Kritische Analyse von Daten aus früheren Versuchen unter Einbeziehung von Ergebnissen aus der sequenziellen Prüfstrategie

• Beschreibung aller einschlägigen Daten aus früheren Versuchen;
• Daten, die in den einzelnen Stufen der Prüfstrategie erhoben wurden;
• Beschreibung der durchgeführten In-vitro-Tests mit Einzelheiten zu den angewendeten Verfahren sowie zu den Ergebnissen für Prüf-/Referenzsubstanzen;
• Beschreibung der durchgeführten In-vivo-Tests auf Hautreizung/-verätzung mit Einzelheiten zu den Ergebnissen;
• Gewichtungsanalyse als Grundlage für die Durchführung einer In-vivo-Studie

Prüfsubstanz:

• Angaben zur Identität (z.B. CAS-Nummer, Bezugsquelle, Reinheit, bekannte Verunreinigungen; Chargennummer):
• physikalische Beschaffenheit und physikalisch-chemische Eigenschaften (z.B. pH-Wert, Flüchtigkeit, Löslichkeit, Stabilität, Reaktionsvermögen mit Wasser);
• bei Gemischen Zusammensetzung und relative Anteile der Bestandteile in Prozent;
• bei lokalen Anästhetika Identität, Reinheit, Art, Dosis und potenzielle Interaktion mit der Prüfsubstanz.

Vehikel:

• Angaben zur Identität, (gegebenenfalls) Konzentration; Einsatzvolumen;
• Begründung der Auswahl des Vehikels.

Versuchstiere:

• verwendete Spezies/Rasse, Begründung für den Verzicht auf die Verwendung von Albino-Kaninchen und die Nutzung anderer Tiere;
• Alter der Tiere bei Beginn der Studie;
• Anzahl der Versuchstiere pro Geschlecht in den Prüf- und Kontrollgruppen (falls erforderlich);
• Gewicht der einzelnen Tiere bei Versuchsbeginn und -ende;
• Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.

Ergebnisse:

• Beschreibung der Methode zur Bewertung von Reizungen zu den jeweiligen Beobachtungszeiten (z.B. Handspaltlampe, Biomikroskop, Fluorescein);
• tabellarische Erfassung der Bewertung von Reizungs-/Verätzungsreaktionen zu allen Messzeitpunkten für jedes einzelne Versuchstier bis hin zum Ausscheiden des Tiers aus dem Versuch;
• ausführliche Beschreibung von Art und Schweregrad der festgestellten Reizung bzw. Verätzung;
• Beschreibung aller anderen im Auge festgestellten Schädigungen (z.B. Vaskularisierung, Pannus, Verklebungen, Verfärbungen);
• Beschreibung sonstiger lokaler und systemischer Folgen außerhalb des Auges und ggfs. vorliegender histopathologischer Befunde.

Diskussion der Ergebnisse

B. 5.3.2 Interpretation der Ergebnisse

Eine Extrapolation der Ergebnisse von Untersuchungen zur Augenreizung an Labortieren auf den Menschen ist nur bedingt möglich. Oftmals reagiert das Albino-Kaninchen empfindlicher als der Mensch auf Stoffe mit augenreizenden oder -verätzenden Eigenschaften.

Bei der Interpretation von Daten ist darauf zu achten, dass Reizungen aufgrund einer sekundären Infektion nicht berücksichtigt werden.

B. 5.4. Literaturhinweise

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, 1., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report B. ATLA 23, 410 - 429.

(2) de Silva, 0., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, 1., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol 35, 159 - 164.

(3) Worth, A.P., und Fentem, J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177

(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.

(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.

(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, S. 483 - 524.

(6a) Prüfmethode B.40 Hautverätzung.

(7) Prüfmethode B.4. Akute Toxizität: Hautreizung/-verätzung.

(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Solna, Schweden, 22. - 24. Januar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Chemikalien, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

Tabelle I: Bewertung von Augenschädigungen

Anhang
Sequenzielle Prüfstrategie für Augenreizungen und -verätzungen

Allgemeine Überlegungen

Im Interesse wissenschaftlicher Verlässlichkeit und des Tierschutzes muss die unnötige Verwendung von Versuchstieren verhindert und die Durchführung von Versuchen, die bei den Tieren wahrscheinlich schwere Reaktionen hervorrufen, auf ein Mindestmaß beschränkt werden. Bevor ein In-vivo-Test ins Auge gefasst wird, sollen zunächst alle einschlägigen Informationen über die potenziell augenreizenden/-verätzenden Wirkungen eines Stoffs ausgewertet werden. Möglicherweise liegen bereits genügend Kriterien für die Einstufung einer Prüfsubstanz anhand ihres Augenreizungs-/-verätzungspotenzials vor, so dass sich Versuche an Labortieren erübrigen. Folglich schränkt die Durchführung einer kritischen Analyse bereits vorliegender Daten und die Anwendung einer sequenziellen Prüfstrategie die Notwendigkeit von In-vivo-Tests deutlich ein. Dies gilt umso mehr, wenn davon auszugehen ist, dass der Stoff schwere Reaktionen hervorruft.

Zur Beurteilung bereits vorhandener Informationen über die augenreizenden/-verätzenden Wirkungen von Substanzen soll das Instrument der Gewichtungsanalyse herangezogen werden. Ausgehend davon ist zu entscheiden, ob zusätzliche Studien, bei denen es sich nicht um In-vivo-Augenuntersuchungen handelt, als Beitrag zur Beurteilung dieses Potenzials erfolgen sollen. Sofern weitere Studien durchgeführt werden müssen, empfiehlt es sich, zur Erzeugung der sachdienlichen Versuchsdaten die sequenzielle Prüfstrategie zu nutzen. Bei noch nicht geprüften Stoffen soll die sequenzielle Prüfstrategie herangezogen werden, um die Daten zu erzeugen, die für die Beurteilung des augenverätzenden/-reizenden Potenzials benötigt werden. Die in diesem Anhang beschriebene Prüfstrategie wurde während eines OECD-Workshops (1) entwickelt Sie wurde im Rahmen des "Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances" bestätigt und weiter ausgebaut, das im November 1998 von den Teilnehmern der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Chemikalien gebilligt wurde (2).

Diese sequenzielle Prüfstrategie gehört zwar nicht zu den integralen Bestandteilen von Prüfmethode B.5, stellt aber gleichwohl den empfohlenen Ansatz zur Ermittlung von augenreizenden/-verätzenden Merkmalen dar. In diesem Ansatz spiegelt sich zum einen die beste Praxis wider. Zum anderen ist er ein ethischer Richtwert für In-vivo-Tests auf augenreizende/-verätzende Wirkungen. Die Prüfmethode bietet nicht nur eine Anleitung zur Durchführung des In-vivo-Tests, sondern auch eine Übersicht über die Faktoren, die vor der Durchführung eines solchen Versuchs überprüft werden sollen. Die sequenzielle Prüfstrategie liefert einen auf einer Gewichtungsanalyse basierenden Ansatz für die Bewertung bereits vorhandener Daten über die augenreizenden/-verätzenden Eigenschaften von Prüfsubstanzen und einen stufenweisen Ansatz für die Erzeugung sachdienlicher Daten über Stoffe, die im Rahmen zusätzlicher Studien untersucht werden müssen bzw. noch gar nicht untersucht wurden. Die Strategie umfasst die Durchführung validierter und anerkannter In-vitro- und Ex-vivo-Tests, in bestimmten Fällen gefolgt von Untersuchungen zur hautreizenden/-verätzenden Wirkung von Stoffen nach Prüfmethode B.4 (Hautreizung/-verätzung) (3)(4).

Beschreibung der Stufenweisen Prüfstrategie

Sämtliche vorhandenen Informationen sollen vor der Durchführung von Versuchen im Rahmen der sequenziellen Prüfstrategie (Fließbild) wertet werden, um die Notwendigkeit von In-vivo-Augentests zu klären. Auch wenn wichtige Informationen aus der Beurteilung einzelner Parameter (z.B. extreme pH-Werte) gewonnen werden können, sollen die bereits vorliegenden Angaben in ihrer Gesamtheit betrachtet werden. Alle relevanten Daten über die Wirkungen des betreffenden Stoffs und struktur verwandter Verbindungen sollen mit Hilfe einer Gewichtungsanalyse bewertet werden, und die Entscheidung soll begründet werden. Dabei sollen bereits vorliegende Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch und Tier im Vordergrund stehen, gefolgt von den Ergebnissen von In-vitro- und Ex-vivo-Tests. In-vivo-Untersuchungen mit Stoffen mit ätzenden Eigenschaften sollten nach Möglichkeit immer vermieden werden. Folgende Faktoren werden in der Prüfstrategie erörtert:

Beurteilung bereits vorliegender Angaben zur Wirkung der Substanz auf Mensch und Tier (Stufe 1). Zunächst sollen vorhandene Informationen über die Wirkung auf den Menschen, z.B. klinische Studien oder Studien zur Exposition am Arbeitsplatz sowie Fallberichte und/oder Ergebnisse von Tierversuchen (Untersuchungen am Auge) bewertet werden, denn sie liefern Hinweise, die unmittelbar die Wirkungen auf das Auge betreffen. Danach sollen vorhandene Daten aus Untersuchungen an Menschen und/oder Tieren zu Hautverätzungen/-reizungen bewertet werden. Stoffe mit bekannter augenätzender oder schwer augenreizender Wirkung sollen nicht in die Augen von Tieren geträufelt werden. Dies gilt ebenso für Substanzen, die Hautreizungen oder -verätzungen hervorrufen. Alle diese Substanzen sollen auch als augenverätzende und/oder -reizende Stoffe betrachtet werden. Auch mit Substanzen, von denen in früheren Augenuntersuchungen hinreichend nachgewiesen wurde, dass sie weder Verätzungen noch Reizungen hervorrufen, sollen keine In-vivo-Studien durchgeführt zu werden.

Analyse der Zusammenhänge zwischen Struktur und Aktivität (SAR) (Stufe 2). Die gegebenenfalls vorhandenen Ergebnisse von Untersuchungen an strukturell verwandten Substanzen sollen berücksichtigt werden. Liegen genügend Daten über das augenverätzende/-reizende Potenzial von strukturell verwandten Substanzen oder Gemischen aus diesen Substanzen aus Untersuchungen an Menschen und/oder Tieren vor, kann davon ausgegangen werden, dass die zu beurteilende Prüfsubstanz die gleichen Reaktionen hervorrufen wird. In diesen Fällen braucht die Prüfsubstanz nicht getestet zu werden. Für die Zwecke der sequenziellen Prüfstrategie reichen negative Daten aus Untersuchungen an strukturell verwandten Substanzen oder Gemischen als Nachweis für ein Nichtvorhandensein augenverätzender/-reizender Wirkungen nicht aus. Zur Ermittlung des Verätzungs- und Reizungspotenzials in Bezug auf die Haut und die Augen sollten validierte und anerkannte SAR-Verfahren herangezogen werden.

Physikalisch-chemische Eigenschaften und chemische Reaktivität (Stuft 3). Stoffe mit extremen pH-Werten (d 2,0 bzw. e11,5) können starke lokale Reaktionen induzieren. Gilt ein extremer pH-Wert als Anhaltspunkt für die augenverätzende oder :reizende Wirkung eines Stoffs, so kann dessen Potenzial zur Veränderung der Azidität/Alkalinität (bzw. das Pufferungsvermögen) ebenfalls berücksichtigt werden (5)(6). Lässt das Pufferungsvermögen darauf schließen, dass eine Substanz möglicherweise keine augenverätzende Wirkung hat, sollen weitere Prüfungen zur Bestätigung dieser Vermutung durchgeführt worden. Dafür sollen validierte und anerkannte In-vitro- oder Ex-vivo-Tests genutzt werden (siehe Stufen 5 und 6).

Einbeziehung weiterer wichtiger Informationen (Stufe 4). In dieser Phase sollen alle verfügbaren Informationen über die systemische Toxizität bei Applikation auf die Haut bewertet werden. Die akute dermale Toxizität der Prüfsubstanz soll ebenfalls beurteilt werden. Hat sich die Prüfsubstanz als sehr giftig bei Hautkontakt erwiesen, braucht sie nicht am Auge getestet zu werden. Auch wenn nicht unbedingt ein Zusammenhang zwischen akuter dermaler Toxizität und Augenreizung/-verätzung bestehts, kann man davon ausgehen, dass ein Stoff, der bei Hautapplikation sehr giftig ist, auch beim Einträufeln in das Auge eine starke Toxizität aufweist. Diese Daten können auch zwischen den Stufen 2 und 3 bewertet werden.

Ergebnisse von In-vitro- und Ex-vivo-Tests (Stufen 5 und 6). Substanzen, deren ätzende oder stark reizende Eigenschaften in validierten und anerkannten, auf die Ermittlung der Augen- oder Hautverätzung/-reizung ausgerichteten In-vitro- oder Ex-vivo-Tests (7)(8) nachgewiesen wurden, brauchen nicht an Tieren geprüft zu werden. Man kann davon ausgehen, dass diese Substanzen in vivo vergleichbare schwere Wirkungen hervorrufen. Stehen validierte und anerkannte In-vitro-/Exvivo-Tests nicht zur Verfügung, können die Stufen 5 und 6 übersprungen und die Auswertungen direkt auf Stufe 7 fortgesetzt werden.

Bewertung der hautreizenden oder -verätzenden Wirkung der Substanz in vivo (Stufe 7). Reichen die aus den vorstehend genannten Studien gewonnenen Erkenntnisse nicht aus, um eine schlüssige Gewichtungsanalyse des Augenreizungs-/-verätzungpotenzials eines Stoffs vornehmen zu können, solle zunächst das In-vivo-Hautreizungs/-verätzungspotenzial anhand von Prüfmethode B.4 (4) und des dazugehörigen Anhangs (9) bewertet werden. Wird der Nachweis erbracht, dass die Substanz Verätzungen oder schwere Hautreizungen verursacht, solle sie solange als Stoff mit augenverätzenden/-reizenden Eigenschaften betrachtet werden, bis weitere Erkenntnisse einen anderen Schluss zulassen. Folglich braucht ein In-vivo-Augentest nicht durchgeführt zu werden. Verursacht die Substanz keine Verätzung oder starke Reizung der Haut, soll ein In-vivo-Augentest erfolgen.

In-vivo-Test an Kaninchen (Stufen 8 und 9). Vor dem eigentlichen In-vivo-Augentest soll zunächst ein Vorversuch an nur einem Tier stattfinden. Es sollen keine weiteren Tests erfolgen, wenn der Vorversuch ergibt, dass die Substanz schwere Augenreizungen oder -verätzungen hervorruft. Liefert der Vorversuch keine Anhaltspunkte für eine ätzende Wirkung oder schwere Reizungen, wird ein Bestätigungstest an zwei weiteren Tieren durchgeführt.

Literaturhinweise

(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Solna, Schweden, 22.-24. Januar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, bestätigt auf der 28. Gemeinsamen Tagung des Chemikalien-Ausschusses und der Arbeitsgruppe Chemikalien, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Clans/HCL6.htm).

(3)Worth, A.P., und Fentem, J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

(4) Prüfmethode B.4. Akute Toxizität: Hautreizung/-verätzung.

(5)Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 - 26.

(6)Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 - 231.

(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G., und Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study an in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, S. 483 - 524.

(8) Prüfmethode B.40 Hautverätzung.

(9) Anhang zur Prüfmethode B.4: Sequenzielle Prüfstrategie für Hautreizungen und -verätzungen.

Fliessbild

Prüf- und Bewertungsstrategie: Augenreizung/-Verätzung

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