umwelt-online: Richtlinie 2006/56/EG zur Änderung der Anhänge der RL 93/85/EWG zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (2)

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6. PCR-TEST

Grundsatz

Wird der PCR-Test als Hauptscreeningtest angewandt und fällt dieser Test positiv aus, so muss obligatorisch als zweiter Screeningtest der IF-Test durchgeführt werden. Wird der PCR-Test als zweiter Screeningtest durchgeführt und fällt der Test positiv aus, so sind zur Sicherung der Diagnose weitere Tests nach dem Flussdiagramm erforderlich.

Dieses Testverfahren wird als Hauptscreeningtest nur empfohlen, wenn es fachkundig durchgeführt werden kann.

Hinweis:

Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 10³ bis 10⁴ Zellen von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen. Möglicherweise sind Optimierungsversuche erforderlich, um in allen Laboratorien ein höchstmögliches Niveau an Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten.

Validierte PCR-Reagenzien und -Protokolle verwenden. Vorzugsweise eine Methode mit interner Kontrolle wählen.

Alle erforderlichen Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination der Probe mit Ziel-DNA zu vermeiden. Der PCR-Test ist von erfahrenen Technikern und in für molekularbiologische Arbeiten vorgesehenen Laboratorien durchzuführen, um das Risiko einer Kontamination mit Ziel-DNA auf ein Mindestmaß zu begrenzen.

Negativkontrollen (für DNA-Extraktions- und PCR-Verfahren) sind stets als letzte Probe zu behandeln, damit nach-vollziehbar bleibt, ob eine DNA-Verschleppung stattgefunden hat.

Die folgenden Negativkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

• Probenextrakt, der zuvor negativ auf C. m. subsp. sepedonicus getestet wurde,
• Pufferkontrollen, die zum Extrahieren des Bakteriums und der DNA aus der Probe verwendet werden,
• PCR-Reaktionsmischung.

Die folgenden Positivkontrollen sollten in den PCR-Test einbezogen werden:

• Aliquots resuspendierter Pellets, denen C. m. subsp. sepedonicus zugegeben wurde (für die Vorbereitung siehe Anlage 2),
• eine Suspension aus 10⁶ Zellen je ml C. m. subsp. sepedonicus in Wasser aus einem virulenten Isolat (z.B. NCPPB 2140 oder NCPPB 4053),
• soweit möglich während des PCR-Tests auch DNA aus positiven Kontrollproben verwenden. Um potenzielle Kontaminationen zu vermeiden, sind Positivkontrollen von den Testproben räumlich getrennt vorzubereiten.

Probenextrakte sollten möglichst frei von Erdresten sein. Daher empfiehlt sich in bestimmten Fällen, Extrakte aus gewaschenen Kartoffeln herzustellen, wenn PCR-Protokolle angewendet werden sollen.

6.1. DNA-Reinigungsmethoden

Positive und negative Kontrollproben wie oben beschrieben verwenden.

Kontrollmaterial wie die Probe(n) vorbereiten.

Es stehen diverse Methoden zur Reinigung der Ziel-DNA aus komplexen Probensubstraten zur Verfügung, wodurch PCR-Inhibitoren entfernt und andere enzymatische Reaktionen ausgeschlossen werden und die Ziel-DNA im Probenextrakt konzentriert wird.

Die folgende Methode wurde zur Verwendung mit der validierten PCR-Methode (siehe Anlage 6) optimiert.

6.1.a. Methode nach Pastrik (2000):

1. 220 μl Lysispuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pipettieren.
2. 100 µl Probenextrakt zugeben und bei 95 °C für 10 Minuten in einen Thermoblock oder ein Wasserbad stellen.
3. Röhrchen 5 Minuten auf Eis kühlen.
4. 80 μl Lysozym-Stammlösung (50 mg Lysozym je ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugeben und für 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
5. 220 μl Easy DNA^® Lösung A (Invitrogen) zugeben, durch Vortexen mischen und bei 65 °C für 30 Minuten inkubieren.
6. 100 μl Easy DNA^® Lösung B (Invitrogen) zugeben und kräftig vortexen, bis das Präzipitat im Röhrchen frei fließt und die Probe gleichmäßig viskös ist.
7. 500 μl Chloroform zugeben und vortexen, bis die Viskosität nachlässt und die Mischung homogen wird.
8. Zur Phasentrennung und Ausbildung der Interphase bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren.
9. Oberphase in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überfuhren.
10. 1 ml 100 % Ethanol (- 20 °C) zugeben, kurz vortexen und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.
11. Bei 15 000 g und 4 °C für 20 Minuten zentrifugieren und das Ethanol vom Pellet entfernen.
12. 500 μl 80 % Ethanol (- 20 °C) zugeben und durch Invertieren des Röhrchens mischen.
13. Bei 15 000 g und 4 °C für 10 Minuten zentrifugieren, das Pellet bewahren und das Ethanol entfernen.
14. Pellet an der Luft oder in einer DNA-Speedvac trocknen lassen.
15. Pellet in 100 μl sterilem Reinstwasser (UPW) resuspendieren und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten stehen lassen.
16. Bei - 20 °C lagern, bis es für die PCR benötigt wird.
17. Etwa vorhandenes weißes Präzipitat abzentrifugieren und 5 μl des DNA-haltigen Überstands für die PCR verwenden.

6.1.b. Andere Methoden

Andere Methoden der DNA-Extraktion (z.B. Qiagen DNeasy Plant Kit) sind akzeptabel, sofern sie DNA aus Kontrollproben mit 10³ bis 10⁴ Zellen des Krankheitserregers je ml nachweislich ebenso wirksam reinigen.

6.2. PCR

6.2.1. Test- und Kontroll-Templates nach dem validierten Protokoll (Anlage 6) für die PCR vorbereiten. Eine Dezimalverdünnung des Proben-DNA-Extrakts (1:10 in UPW) herstellen.

6.2.2. Nach dem vorgegebenen Protokoll (Anlage 6) in einem kontaminationsfreien Umfeld eine geeignete PCRReaktionsmischung herstellen. Das validierte PCR-Protokoll ist eine multiplexe Reaktion, die auch eine interne PCR-Kontrolle enthält.

6.2.3. 5 μl DNA-Extrakt je 25 μl PCR-Reaktion in sterile PCR-Röhrchen geben.

6.2.4. Eine negative Kontrollprobe mit ausschließlich PCR-Reaktionsmischung einbeziehen und anstelle der Probe UPW zugeben, das zur Herstellung der PCR-Mischung verwendet wird.

6.2.5. Die Röhrchen in den Thermocycler stellen, der für die vorausgehenden Tests verwendet wurde, und das entsprechend optimierte PCR-Programm (Anlage 6) verwenden.

6.3. Analyse des PCR-Produktes

6.3.1. PCR-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen. Dazu mindestens 12 pl amplifizierte DNA-Reaktionsmischung jeder Probe, mit 3 µl Beladungspuffer (Anlage 6) gemischt, in 2,0 %igem (w/v) Agarose-Gelen in Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer (Anlage 6) bei 5-8 V je cm laufen lassen. Einen geeigneten DNA-Marker, z.B. 100 bp ladder, verwenden.

6.3.2. DNA-Banden durch Anfärben in Ethidiumbromid (0,5 mg je 1) für 30-45 Minuten sichtbar machen. Dieses Mutagen vorsichtig handhaben.

6.3.3. Das angefärbte Gel unter UV-Transillumination (z.B. √ = 302 nm) auf amplifizierte PCR-Produkte der erwarteten Größe (Anlage 6) untersuchen und dokumentieren.

6.3.4. Bei neuen Feststellungen/Fällen ist die Authentizität des PCR-Fragments durch Restriktionsenzymanalyse an einer Probe der verbliebenen amplifizierten DNA zu bestätigen, d. h. die Probe bei optimaler Temperatur und Zeitdauer mit einem geeigneten Enzym und Puffer (siehe Anlage 6) zu inkubieren. Die verdauten Fragmente wie zuvor durch Agarose-Gelelektrophorese auftrennen, nach Anfärben mit Ethidiumbromid charakteristische Restriktionsfragmentmuster unter UV-Transillumination prüfen und mit der unverdauten und verdauten Positivkontrolle vergleichen.

Auswertung des PCR-Testergebnisses:

Der PCR-Test ist negativ, wenn das C. m. subsp. sepedonicus spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe nicht für die untersuchte Probe, jedoch für alle positiven Kontrollproben nachgewiesen wird (bei der Multiplex-PCR mit pflanzenspezifischen internen Kontrollprimern muss ein zweites PCR-Produkt in erwarteter Größe in der untersuchten Probe amplifiziert werden).

Der PCR-Test ist positiv, wenn das C. m. subsp. sepedonicus spezifische PCR-Produkt der erwarteten Größe und (soweit erforderlich) des erwarteten Restriktionsmusters nachgewiesen wird, vorausgesetzt, es wird nicht in einer der negativen Kontrollproben amplifiziert. Ein positiver Befund kann auch durch Wiederholung des Tests mit einem zweiten PCR-Primerset (Abschnitt 9.3) verlässlich bestätigt werden.

Hinweis:

Es besteht Verdacht auf PCR-Hemmung, wenn das erwartete Fragment aus der positiven Kontrollprobe stammt, die C. m. subsp. sepedonicus in Wasser enthält, bei positiven Kontrollproben, die C. m. subsp. sepedonicus in Kartoffelextrakt enthalten, jedoch negative Ergebnisse erzielt werden. In Multiplex-PCR-Protokollen mit internen PCR-Kontrollen liegt eine Reaktionshemmung vor, wenn keines der beiden Fragmente erhalten wird.

Es besteht Verdacht auf Kontamination, wenn das erwartete Fragment in einer oder mehrerer der Negativkontrollen erhalten wird.

7. Biotest

Hinweis:

Vorausgehende Tests mit diesem Verfahren müssen gewährleisten, mindestens 10³ bis 10⁴ koloniebildende Einheiten von C. m. subsp. sepedonicus je ml, die Probenextrakten mit zuvor negativem Testergebnis zugefügt wurden, reproduzierbar nachzuweisen (für die Vorbereitung siehe Anlage 2).

Optimale Nachweisempfindlichkeit ist unter optimalen Wachstumsbedingungen und bei Verwendung von frisch hergestelltem Probenextrakt gegeben. Die Methode ist jedoch auch für Extrakte geeignet, die bei - 68 bis - 86 °C unter Glyzerinzugabe gelagert wurden.

Einige Auberginensorten sind ein ausgezeichnetes selektives Anreicherungsmedium für das Wachstum von C. m. subsp. sepedonicus, selbst wenn keine Symptome erkennbar sind, und perfekt geeignet für Bestätigungstests an der Wirtpflanze.

Die Wachstumsbedingungen müssen optimal sein, um falsch-negative Testergebnisse zu vermeiden. Für Einzelheiten zur Kultivierung siehe Anlage B.

7.1. Das gesamte restliche Testaliquot des resuspendierten Pellets (siehe Abschnitt 3.1.6 bzw. 3.2.5) nach einer der nachstehend beschriebenen Methoden (Abschnitt 7.3 oder 7.4) auf die Auberginenpflanzen verteilen. Nur Pflanzen im Blattstadium 2-3, d. h. bis zur vollen Ausbildung des dritten Blattes, verwenden. Um zu gewährleisten, dass das resuspendierte Pellet vollständig verwendet wird und die Beimpfung wirksam ist, sind für die nachstehend beschriebenen Verfahren 15-25 Auberginen je Probe erforderlich.

7.2. Die Auberginen für 1 bis 2 Tage vor der Beimpfung nicht wässern, um den osmotischen Druck (Turgor) zu verringern.

7.3. Schlitzinokulation

7.3.1. Die Auberginenpflanze zwischen zwei Fingern halten, einen Tropfen (etwa 5 bis 10 µl) des suspendierten Pellets zwischen den Keimblättern und dem ersten Blatt auf den Stängel pipettieren.

7.3.2. Mit einem sterilen Skalpell den Stängel vom Pellettropfen aus diagonal 1,0 cm lang und etwa zwei Drittel der Stängeldicke tief einritzen.

7.3.3. Den Schnitt mit steriler Vaseline (Spritze) versiegeln.

7.4. Spritzeninokulation

Die Auberginenstängel mit einer Spritze, die mit einer hypodermischen Nadel (nicht weniger als 23G) versehen ist, direkt über den Keimblättern beimpfen. Die Probe auf die Auberginenpflanze verteilen.

7.5. Als Positivkontrollen 5 Auberginenpflanzen nach derselben Inokulationsmethode (7.3 bzw. 7.4) mit einer wässrigen Suspension von 10⁵ bis 10⁶ Zellen je ml einer bekannten Kultur von C. m. subsp. sepedonicus und, soweit möglich, mit natürlich infiziertem Knollengewebe (siehe Abschnitt 4) beimpfen.

7.6. Als Negativkontrolle 5 Pflanzen nach derselben Inokulationsmethode (7.3 bzw. 7.4) mit sterilem Pelletpuffer beimpfen.

7.7. Die Pflanzen in Quarantäneeinrichtungen bei 18-24 °C für bis zu vier Wochen inkubieren. Dabei für ausreichende Beleuchtung und hohe Feuchtigkeit (70-80 %) sorgen und regelmäßig wässern, um Staunässe oder Welken durch Wassermangel zu verhindern. C. m. subsp. sepedonicus Zellen werden bei Temperaturen von über 30 °C abgetötet; die optimale Temperatur liegt bei 21 °C. Um Kontaminationen zu vermeiden, positive und negative Kontrollpflanzen auf getrennten Arbeitstischen in einem Gewächshaus oder einer Wachstumskammer inkubieren oder, bei Platzmangel, sicherstellen, dass die Behandlungen streng getrennt erfolgen. Müssen verschiedene Proben eng nebeneinander inkubiert werden, so sind sie durch geeignete Schutzwände zu trennen. Beim Düngen, Wässern, Untersuchen oder anderen Behandlungen sind alle erforderlichen Vorkehrungen zu treffen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Gewächshäuser und Wachstumskammern müssen unbedingt frei von Insekten jeder Art gehalten werden, da diese das Bakterium von Probe zu Probe übertragen können.

7.8. Nach einer Woche regelmäßig auf Symptome untersuchen. Pflanzen mit Symptomen zählen. C. m. subsp. sepedonicus verursacht Welken, das mit einer Schlaffheit der Blätter an den Rändern oder zwischen den Blattnerven beginnen kann. Welkes Gewebe kann zunächst dunkelgrün oder gesprenkelt aussehen, erblasst jedoch, bevor es nekrotisch wird. Welke Stellen zwischen den Blattnerven haben häufig ein öliges wässrig durchtränktes Aussehen. Nekrotisches Gewebe hat oft einen hellgelben Rand. Die Auberginen sterben nicht unbedingt ab; je länger es dauert, bis sich Symptome entwickeln, desto größer die Überlebenschancen. Die Pflanzen können aus der Infektion herauswachsen. Junge Auberginen sind gegenüber niedrigen Populationen von C. m. subsp. sepedonicus wesentlich empfindlicher als ältere Pflanzen; deshalb sollten die Pflanzen im oder kurz vor Blattstadium 3 verwendet werden.

Das Welken kann auch durch das Vorhandensein anderer Bakterien oder Pilze hervorgerufen werden, die sich im Knollengewebepellet befinden. Dazu gehören Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora und E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata sowie große Populationen saprophytischer Bakterien. Insbesondere Erwinia chrysanthemi kann Blattsymptome und eine Welke hervorrufen, die den Welkesymptomen von C. m. subsp. sepedonicus sehr ähnlich ist. Der einzige Unterschied besteht darin, dass die Stängel bei Erwinia-chrysanthemi-Infektionen schwarz werden. Andere Welken lassen sich von der durch C. m. subsp. sepedonicus hervorgerufenen Welke dadurch unterscheiden, dass rasch ganze Blätter oder ganze Pflanzen welken. Zur Differenzierung zwischen C. m. subsp. sepedonicus und Erwinia spp. kann auch eine Gram-Färbung vorgenommen werden.

7.9. Sobald an den Auberginenpflanzen Symptome festgestellt werden, sollte an welken Blattabschnitten oder Stängelteilen der Pflanzen (siehe 3.1.3 für Gewebezerkleinerung) eine Reisolierung vorgenommen werden. Die Oberfläche der Auberginenblätter und -stängel durch Abreiben mit 70 % igem Ethanol desinfizieren. Einen IF- oder PCR-Test am Pflanzensaft durchführen und auf einem geeigneten (selektiven) Medium (siehe Abschnitt 8) isolieren. Es kann auch eine Gram-Färbung (siehe Anlage 9) vorgenommen werden. Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten identifizieren und die Pathogenität bestätigen (siehe Abschnitte 9 und 10).

7.10. Unter bestimmten Umständen, insbesondere dann, wenn die Wachstumsbedingungen nicht optimal sind, kann es vorkommen, dass C. m. subsp. sepedonicus in den Auberginen selbst nach einer Inkubationszeit von bis zu vier Wochen als latente Infektion weiter besteht. Werden nach vier Wochen keine Symptome festgestellt, den IF-IPCRTest an einer Mischprobe von 1 cm langen Stängelabschnitten jeder Testpflanze, die über der Inokulationsstelle herausgeschnitten werden, durchführen. Fällt der Test positiv aus, so sollte nach dem Verfahren gemäß Abschnitt 8 eine Reisolierung auf geeigneten (selektiven) Medien vorgenommen werden. Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten identifizieren und die Pathogenität bestätigen (siehe Abschnitte 9 und 10).

Auswertung des Biotest-Ergebnisses:

Gültig sind Biotest-Ergebnisse, wenn Pflanzen der Positivkontrolle typische Symptome zeigen, das Bakterium aus diesen Pflanzen reisoliert werden kann und bei den Negativkontrollen keine Symptome festgestellt werden.

Das Testergebnis ist negativ, wenn die Testpflanzen nicht mit C. m. subsp. sepedonicus infiziert sind und sofern C. m. subsp. sepedonicus in Positivkontrollen nachgewiesen wird.

Das Testergebnis ist positiv, wenn die Testpflanzen mit C. m. subsp. sepedonicus infiziert sind.

8. Isolierung von C. m. subsp. sepedonicus

Hinweis:

Die Diagnose gilt erst als gesichert, wenn C. m. subsp. sepedonicus isoliert und anschließend identifiziert (siehe Abschnitt 9) und durch einen Pathogenitätstest (Abschnitt 10) bestätigt wird. Obgleich C. m. subsp. sepedonicus ein anspruchsvoller Organismus ist, lässt er sich dennoch aus symptomatischem Gewebe isolieren.

Der Erreger kann jedoch von rasch wachsenden saprophytischen Bakterien überwuchert werden; daher ist das Isolieren direkt aus dem Knollen- oder Stängelgewebepellet (Abschnitt 3.1.6 bzw. 3.2.5) schwierig. Mit selektivem Medium und einer geeigneten Verdünnung der resuspendierten Pellets aus Nabelendenstücken der Kartoffel oder Stängeln von Kartoffelpflanzen lässt sich C. m. subsp. sepedonicus möglicherweise direkt isolieren.

Isolierungen sind bei allen Kartoffelknollen oder Stängelstücken mit entsprechenden Symptomen und bei Auberginen vorzunehmen, bei denen zwar keine Symptome festgestellt werden, deren Mischprobe bei der IF-/PCR-Testung jedoch positiv ausgefallen ist (siehe Abschnitt 7.10). Ist eine Zerkleinerung von Auberginenstängeln erforderlich, so sollte sie nach den Vorgaben vom Abschnitt 3.1.3 durchgeführt werden.

Als Positivkontrollen sind Dezimalverdünnungen aus einer Suspension von 10⁶ cfu je ml C. m. subsp. sepedonicus (z.B. NCPPB 4053 oder PD 406) herzustellen. Um jegliches Risiko einer Kontamination zu vermeiden, sind die Positivkontrollen von den Testproben völlig getrennt herzustellen.

Für jede neu hergestellte Charge eines Selektivmediums ist dessen Eignung für das Wachstum des Erregers zu prüfen, bevor es zur Untersuchung von Routineproben verwendet wird.

Das Kontrollmaterial nach demselben Verfahren wie die Probe(n) testen.

8.1. Selektivauutrich

8.1.1. Aus einem 100 μl Aliquot einer resuspendierten Kartoffelpelletprobe oder von Auberginensaft 10fache Verdünnungen in Pelletpuffer (Anlage 3) herstellen.

8.1.2. Die Isolierung aus unverdünntem Kartoffelpellet gelingt aufgrund des problematischen Wachstumsverhaltens des Erregers und der Konkurrenz durch Saprophyten in der Regel nicht. Da das Bakterium gewöhnlich in hohen Populationen in infiziertem Gewebe vorliegt, können die Saprophyten in der Regel ausverdünnt werden, während der Erreger noch vorhanden bleibt. Daher wird empfohlen, 100 μl von jeder Probe, 1/100 bis 1/10 000 verdünnt, mit Ausstrichspateln ("hocket sticks") nach dem Ausstrichverfahren auf MTNA-Medium oder NCP-88-Medium (Anlage 5) auszustreichen (für 90 mm Petrischalen geeignet, die Menge bei Verwendung anderer Schalengröße anpassen).

Hinweis:

Alternativ kann das ursprüngliche 100 Id Kartoffelpelletaliquot (1/100) mit einem Spatel auf einer ersten Agarplatte ausgestrichen werden. Anschließend das noch am Spatel anhaftende Restaliquot auf einer zweiten Agarplatte ausstreichen und den Vorgang schließlich mit einer dritten Platte wiederholen, wodurch mit dem Spatel ein Verdünnungsausstrich erreicht wird.

8.1.3. Die Platten im Dunkeln bei 21-23 °C inkubieren.

8.1.4. Die Platten nach drei Tagen erstmals untersuchen und, im Vergleich zu den Referenzplatten, alle C. m. subsp. sepedonicus ähnlichen Kolonien zählen; weitere Zählungen nach 5, 7 und ggf 10 Tagen vornehmen.

8.2. Reinigung verdächtiger Kolonien

Hinweis:

Für die Inokulation der Auberginen und/oder anschließende Identifizierung sind C. m. subsp. sepedonicus ähnliche Kolonien zuvor auf YGM-Medium zu kultivieren; dies sollte geschehen, bevor die Platten all zu überwachsen sind, d. h. vorzugsweise nach 3-5 Tagen.

8.2.1. C. m. subsp. sepedonicus ähnliche Kolonien auf einem der folgenden Medien ausstreichen (Zusammensetzung siehe Anlage 5):

Dextrose-Nähragar (nur für die Subkultivierung verwenden),

Hefe-Pepton-Glucose-Agar,

Hefeextrakt-Mineralsalz-Agar.

Maximal 10 Tage bei 21-24 °C inkubieren.

C. m. subsp. sepedonicus wächst langsam und bildet innerhalb von 10 Tagen in der Regel winzige, cremefarbene, kuppelförmige Kolonien (für Fotos typischer Kolonien von C. m. subsp. sepedonicus siehe Internet-Website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Zur Herstellung der Reinkultur erneut ausstreichen.

Die Wachstumsgeschwindigkeit verbessert sich mit der Subkultivierung. Typische Kolonien sind cremig-weiß oder elfenbeinfarben, gelegentlich auch gelb, abgerundet, glatt, erhöht, konvex gewölbt, schleimig-flüssig, mit glatten Rändern und einem Durchmesser von in der Regel 1 bis 3 mm.

Eine einfache Gram-Färbung (siehe Anlage 9) kann bei der Auswahl von Kolonien für weitere Testungen hilfreich sein.

8.2.3. Verdächtige Kulturen identifizieren (siehe Abschnitt 9) und einen Pathogenitätstest durchführen (siehe Abschnitt 10).

9. Identifizierung

Reinkulturen von C. m. subsp. sepedonicus verdächtigen Isolaten mit mindestens zwei der folgenden Testmethoden, die auf unterschiedlichen biologischen Grundsätzen beruhen, identifizieren.

Für jeden durchgeführten Test ggf. bekannte Referenzstämme einbeziehen.

9.1. Nähr- und enzymatische Tests zur Identifizierung

Die folgenden phänotypischen Eigenschaften, die bei C. m. subsp. sepedonicus entweder allgemein vorhanden oder nicht vorhanden sind, nach den Methoden von Leihott and Stead (1987), Mement et al. (1990), Schaad (2001) und Anonymous (1987) bestimmen.

Alle Medien bei 21 °C inkubieren und nach sechs Tagen untersuchen. Wird kein Wachstum festgestellt, maximal 20 Tage weiter inkubieren.

Alle Tests müssen eine bekannte C. m. subsp. sepedonicus Kontrolle einschließen. Nährtests und physiologische Tests müssen mit Inokula aus Nähragar-Subkulturen durchgeführt werden. Morphologische Vergleiche müssen auf Dextrose-Nähragar-angezogenen Kulturen durchgeführt werden.

9.2. IF-Test

1. Eine Suspension von annähernd 10⁶ Zellen je ml in IF-Puffer herstellen (siehe Anlage 3).
2. Eine 2fache Verdünnungsreihe eines geeigneten Antikörpers herstellen.
3. IF-Verfahren anwenden (siehe Abschnitt 4).
4. Der IF-Test ist positiv, wenn der IF-Titer der Kultur dem der Positivkontrolle entspricht.

9.3. PCR-Test

1. Eine Suspension von annähernd 10⁶ Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.
2. 100 μ l der Zellsuspension in geschlossenen Röhrchen in einem Thermoblock oder Siedewasserbad bei 100 °C für 4 Minuten erhitzen. Erforderlichenfalls kann die Zelllysis durch Zugabe frisch zubereiteter NaOH mit einer Endkonzentration von 0,05M unterstützt werden. Die Proben können anschließend bis zu ihrer Verwendung bei -16 bis - 24 °C gelagert werden.
3. Geeignete PCR-Verfahren anwenden, um C. m: subsp: sepedonkus-spezifische PCR-Produkte (z.B. Pastrik, 2000; siehe Anlage 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999) zu amplifizieren.
4. C. m. subsp. sepedonicus gilt als positiv identifiziert, wenn die PCR-Produkte dieselbe Größe und dieselben Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen aufweisen wie der positive Kontrollstamm.

9.4. FISH-Test

1. Eine Suspension von annähernd 10⁶ Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.
2. FISH-Verfahren anwenden (siehe Abschnitt 5).
3. Der FISH-Test ist positiv, wenn die Kultur ebenso reagiert wie die Positivkontrolle.

9.5. Bestimmung des Fettsäureprofils (FAP)

1. Die Kultur auf Trypticase-Soja-Agar (Oxoid) für 72 Stunden bei 21 °C (+/- 1°) anzüchten.
2. Ein geeignetes FAP-Verfahren anwenden Qanse, 1991; Stead, 1992).
3. Ein FAP-Test ist positiv, wenn das Profil der verdächtigen Kultur mit dem der Positivkontrolle identisch ist. Das Vorliegen charakteristischer Fettsäuren (15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 und 17:0 Anteiso) deutet mit hoher Sicherheit auf C. m. subsp. sepedonicus hin. Andere Gattungen wie Curtobacterium, Arthrobacter und Micrococcus weisen einige dieser Säuren ebenfalls auf, 15:1 Anteiso A ist bei diesen Bakterien jedoch eine Seltenheit, kommt allerdings zwischen 1-5 % in allen Clavibacter spp. vor. In C. m. subsp. sepedonicus liegt der Wert in der Regel bei 5 %.

9.6. BOX-PCR

1. Eine Suspension aus annähernd 10⁶ Zellen je ml in Reinstwasser (UPW) herstellen.
2. Den Test nach dem entsprechenden Verfahren durchführen (Smith et al., 2001).

10. Bestätigungstest

Der Pathogenitätstest dient der endgültigen Bestätigung der Diagnose von C. m. subsp. sepedonicus und der Bewertung der Virulenz von als C. m. subsp. sepedonicus identifizierten Kulturen.

10.1. Aus drei Tage alten Kulturen des zu testenden Isolats und einem geeigneten positiven Kontrollstamm von C. m. subsp. sepedonicus ein Inokulum mit einer Zelldichte von etwa 10⁶/ml herstellen.

10.2. 5-10 Stängel junger Auberginensämlinge im Blattstadium 3 beimpfen (siehe Abschnitt 7.3 oder 7.4).

10.3. Die Pflanzen bei 18-24 °C inkubieren. Dabei für ausreichende Beleuchtung und hohe relative Feuchtigkeit sorgen und regelmäßig wässern, um Staunässe bzw. Trockenheitsstress zu verhindern (siehe Abschnitt 7.7). Bei Reinkulturen setzt die typische Welke innerhalb von zwei Wochen ein, symptomfreie Pflanzen (siehe Abschnitt 7.8) sollten danach jedoch für bis zu drei Wochen inkubiert werden, und zwar bei Temperaturen, die das Auberginenwachstum fördern, jedoch 25 °C nicht überschreiten (siehe Anlage 8). Treten nach drei Wochen keine Symptome auf, so kann die Kultur nicht als eine pathogene Form von C. m. subsp. sepedonicus bestätigt werden.

10.4. Von Pflanzen mit Symptomen wie folgt isolieren: Ein Stängelstück 2 cm oberhalb der Inokulationsstelle herausschneiden, zerkleinern und in wenig sterilem destilliertem Wasser oder 50 mM Phosphatpuffer (siehe Anlage 3) suspendieren. Aus der Suspension durch Verdünnungsausstrich oder Ausstrich auf MTNA und YPGA (siehe Anlage 5) isolieren, 3-5 Tage bei 21-23 °C inkubieren und auf Bildung typischer C. m. subsp. sepedonicus Kolonien achten.

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Eine 72 Stunden alte Kultur eines virulenten Stammes von C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 oder PD 406] auf MTNABasismedium anzüchten und in 10 mM Phosphatpuffer suspendieren, um eine Zelldichte von annähernd 1 bis 2 X 10⁸ cfu je ml zu erhalten. Dieses Ergebnis wird in der Regel erzielt durch eine leicht trübe Suspension mit einer optischen Dichte von 0,20 bei 600 nm.

An den Nabelenden von 200 Knollen einer gelbschaligen Kartoffelsortenpartie, die nachweislich frei von C. m. subsp. sepedonicus ist, Stückchen aus dem Gefäßbündelring herausschneiden.

Die Nabelenden wie gewöhnlich verarbeiten und das Pellet in 10 ml resuspendieren. 10 sterile 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 900 μl des resuspendierten Pellets herstellen.

100 μl der Suspension von C. m. subsp. sepedonicus in das erste Röhrchen geben und vortexen. In den nächsten fünf Röhrchen weitere Dezimalverdünnungen anlegen.

Die sechs kontaminierten Röhrchen als Positivkontrollen, die vier nicht kontaminierten Röhrchen als Negativkontrollen verwenden. Die Röhrchen entsprechend beschriften.

100 μl Aliquots in sterilen 1,5-ml-Röhrchen anlegen, um von jeder Kontrollprobe 9 Parallelproben zu erhalten. Bis zur weiteren Verwendung bei -16 bis - 24 °C lagern.

Das Vorhandensein und die Quantifizierung von C. m. subsp. sepedonicus in den Kontrollproben sollte zunächst durch den IF-Test bestätigt werden.

Für den PCR-Test bei jeder Testprobenreihe eine DNA-Extraktion aus positiven und negativen Kontrollproben vornehmen. Für den IF- und FISH-Test bei jeder Testprobenreihe positive und negative Kontrollproben testen.

Beim IF-, FISH- und PCR-Test muss C. m. subsp. sepedonicus zumindest in den Positivkontrollen mit 10⁶ und 10⁴ Zellen/ml, darf jedoch in keiner der Negativkontrollen nachgewiesen werden.

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Allgemeine Anmerkung: Sterile Puffer können ungeöffnet bis zu einem Jahr lang gelagert werden.

1. Puffer für Extraktionsverfahren

1.1. Extraktionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0)

Dieser Puffer wird für die Extraktion des Bakteriums aus Pflanzengewebe durch Homogenisierung oder Schütteln verwendet.

Substanzen lösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren. Die folgenden zusätzlichen Komponenten können zweckdienlich sein:

1.2. PelkWuffer (10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2)

Dieser Puffer wird für die Resuspendierung und Verdünnung von Extrakten von Gewebestückchen verwendet, die an den Nabelenden von Kartoffelknollen herausgeschnitten wurden, nachdem sie durch Zentrifugieren zu Pellets konzentriert worden waren.

Substanzen auflösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.

2. Puffer für den IF-Test

2.1. IF-Puffer (10 mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2) Dieser Puffer wird für die Verdünnung von Antikörpern verwendet.

Substanzen auflösen, pH-Wert messen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.

2.2. IF-Puffer-Tween

Dieser Puffer wird zum Waschen von Objektträgern verwendet. 0,1 % Tween 20 zum IF-Puffer geben.

2.3. Phosphatgepuffertes Glyzerin, pH 7,6

Dieser Puffer wird als Einbettungsmittel auf den Feldern der IF-Objektträger zur Verbesserung der Fluoreszenz verwendet.

Antifading-Eindeckungsmittel sind beispielsweise als Vectashield® (Vector Laboratories) oder Citifluor® (Leica) im Handel erhältlich.

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1. Mittlere Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je Sichtfeld (c) zählen.

2. Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je Mikroskopfeld des Objektträgers (C) berechnen.

C = c x S/s

3. Anzahl typischer fluoreszierender Zellen je ml resuspendiertes Pellet

(N berechnen. N=C x 1000/y x F

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a. Universalnährrnedien

Substanzen auflösen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.

Dextrose-Nähragrar (NDA)

Difco-Bacto-Nähragrar mit 1 % D(+)-Glucose (Monohydrat). Sterilisieren durch 20-minütiges Autoklavieren bei 115 °C.

Hefe-Pepton-Glucose-Agar (YPGA)

Substanzen auflösen und durch 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C sterilisieren.

Hefeextrakt-Mineralsalzmedium (YGM)

Substanzen auflösen und je 1/2 Liter des Mediums durch 20-minütiges Autoklavieren bei 115 °C sterilisieren.

b.Validierte Selektimähnnedien

MTNA-Medium

Soweit nicht anders angegeben, stammen alle Komponenten des Mediums von BDH.

Substanzen auflösen und pH auf 7,2 einstellen. Nach 15-minütigem Autoklavieren bei 121 °C und Abkühlen auf 50 °C die Antibiotika Trimethoprim 0,06 g, Nalixidinsäure 0,002 g, Amphotericin B 0,01 g zugeben.

Antibiotika-Stammlösungen: Trimethoprim (Sigma) und Nalixidinsäure (Sigma) (beide 5 mgiml) in 96 %igem Methanol, Amphotericin B (Sigma) (1 mgiml) in Dimethylsulfoxid. Stammlösungen sind filtersterilisiert.

Hinweis:

Basismedium ist 3 Monate lang haltbar. Nach Zugabe von Antibiotika beträgt die Haltbarkeitsdauer bei Kiihlschranklagenmg 1 Monat.

NCP-88-Medium

Substanzen auflösen und pH auf 7,2 einstellen. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf 50 °C die Antibiotika Polymyxin-B-sulfat (Sigma) 0,003g, Nalixidinsäure (Sigma) 0,008 g und Cycloheximid (Sigma) 0,2 g zugeben.

Antibiotika wie folgt in Stammlösungen auflösen: Nalixidinsäure in 0,01 M NaOH, Cycloheximid in 50 %igem Ethanol, Polymyxin-B-sulfat in destilliertem Wasser. Stammlösungen sind filtersterilisiert.

Hinweis:

Basismedium ist 3 Monate lang haltbar. Nach Zugabe von Antibiotika beträgt die Haltbarkeitsdauer bei Kiihlschranklagenmg 1 Monat.

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Hinweis:

Vorausgehende Tests müssen den reproduzierbaren Nachweis von mindestens 10³ bis 10⁴ Zellen von C. m. sepedoniaas je ml Probenextrakt garantieren.

Vorausgehende Tests dürfen keine falsch-positiven Ergebnisse bei bestimmten ausgewählten Bakterienstämmen zeigen.

1. Multiplex-PCR-Protokoll mit interner PCR-Kontrolle (Pastrik, 2000)

1.1. Oligonucleotid-Primer

Erwartete Fragmentlänge des C: m: subsp: sepedonicus-spezifischen PCR-Produktes = 502 bp (PSA-Primerset).

Erwartete Fragmentlänge der 18S-rRNA-internen PCR-Kontrolle = 377 bp (NS-Primerset).

1.2. PCR-Reaktionsmischung

1.3. PCR-Reaktionsbedingungen

Programmablauf:

Hinweis:

Dieses Programm wurde für den MJ-Research-PTC-200-Thermocycler optimiert. Bei anderen Modellen (Geräten) kann eine Änderung der Dauer der Zyklusschritte ii, iii, iv, v, vi und vii erforderlich sein.

1.4. Restriktionsenzymanalyse des Fragments

PCR-Produkte, die von C: m: subsp: sepedonicus-DNA amplifiziert werden, zeigen nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C mit Enzym Bgl II einen erkennbaren Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus. Die Restriktionsfragmente der C: m: subsp: sepedonicus-spezifischen Fragmente haben eine Größe von 282 bp und 220 bp.

weiter .