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Neufassung - Ersetzt VO (EWG) 4154/87

Die Kommission der Europäischen Gemeinschaften -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 des Rates vom 23. Juli 1987 über die zolltarifliche und statistische Nomenklatur sowie den Gemeinsamen Zolltarif ¹, insbesondere auf Artikel 9,

In Erwägung nachstehender Gründe:

(1) Die Verordnung (EWG) Nr. 4154/87 der Kommission vom 22. Dezember 1987 zur Festlegung der Analysenmethoden und anderer technischer Bestimmungen für die Anwendung der Verordnung (EWG) Nr. 3033/80 des Rates betreffend die Handelsregelung für bestimmte aus landwirtschaftlichen Erzeugnissen hergestellte Waren ² ist in wesentlichen Punkten geändert worden ³. Aus Gründen der Übersichtlichkeit und Klarheit empfiehlt es sich daher, die genannte Verordnung zu kodifizieren.

(2) Um die einheitliche Behandlung von Waren, auf die die Verordnung (EG) Nr. 3448/93 des Rates vom 6. Dezember 1993 über die Handelsregelung für bestimmte aus landwirtschaftlichen Erzeugnissen hergestellte Waren ⁴ Anwendung findet, bei der Einfuhr in die Gemeinschaft sicherzustellen, ist es erforderlich, unter Berücksichtigung der wissenschaftlichen und technischen Entwicklung Analysenmethoden und andere technische Bestimmungen festzulegen.

(3) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ausschusses für den Zollkodex, Fachbereich Zolltarifliche und Statistische Nomenklatur -

- hat folgende Verordnung erlassen:

Artikel 1  Anwendungsbereich ¹¹

Diese Verordnung legt Folgendes fest:

1. die Methodik und die Analysemethoden, die zur Bestimmung des Gehalts landwirtschaftlicher Erzeugnisse im Sinne des Artikels 2 Absatz 1 Buchstabe a der Verordnung (EG) Nr. 1216/2009 des Rates ⁵ oder ihrer spezifischen Teilbeträge, die als in importierten Waren enthalten im Sinne des Artikels 2 Absatz 1 Buchstabe b der Verordnung (EG) Nr. 1216/2009 betrachtet werden, heranzuziehen sind;
2. die erforderlichen Analysemethoden, die zur Umsetzung der Verordnung (EG) Nr. 1216/2009 im Hinblick auf die Einfuhren, des Anhangs I der Verordnung (EWG) Nr. 2658/1987 und der Durchführungsverordnung (EU) Nr. 514/2011 ⁶ heranzuziehen sind; statt einer Analysenmethode können nur die verschiedenen Schritte eines anzuwendenden Verfahrens aufgezeigt oder das einer anzuwendenden Methode zugrunde liegende Prinzip genannt werden.

Artikel 2 Berechnung des Gehalts ^{11 15}

Gemäß den in den Fußnoten 1, 2 und 3 des Anhangs III der Verordnung (EU) Nr. 514/2011 und in den Fußnoten 1, 2 und 3 der Tabelle 1 des Anhangs 1 in Teil III, Abschnitt I, Anhang I der Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 aufgeführten Begriffsbestimmungen bezüglich des Gehalts an Milcheiweiß, Stärke/Glucose und Saccharose/Invertzucker/Isoglucose sind die folgenden Formeln, Verfahrensweisen und Methoden anzuwenden

1. zur Anwendung der Anhänge II und III der Verordnung (EU) Nr. 514/2011
2. zur Bestimmung des Gehalts an Milchfett, Milcheiweiß, Stärke/Glucose und Saccharose/Invertzucker/Isoglucose zur Auswahl des angemessenen Agrarteilbetrags, des Zusatzzolls Zucker und des Zusatzzolls Mehl im Fall nicht präferenzieller Einfuhren wie in Teil II und Teil III, Abschnitt I, Anhang 1 des Anhangs I der Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 vorgesehen:
   1. Gehalt an Stärke/Glucosegehalt

      (berechnet als Stärke Trockensubstanz, Reinheit 100 %, bezogen auf die Ware)

      1. (Z - F) × 0,9,

         wenn der Glucosegehalt gleich hoch oder höher ist als der Fructosegehalt; oder

      2. (Z - G) × 0,9,

         wenn der Glucosegehalt niedriger ist als der Fructosegehalt.

      In den Formeln bedeuten:
      Z = Glucosegehalt in der Ware, bestimmt nach der Methode in Anhang I dieser Verordnung;
      F = Fructosegehalt in der Ware, bestimmt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC);
      G = Glucosegehalt in der Ware, bestimmt mittels HPLC.

      Wenn im Fall von Buchstabe a hydrolysierte Lactose als Bestandteil der Ware angemeldet und/oder Lactose und Galactose neben anderen Zuckern festgestellt werden, so ist die der Galactosemenge (HPLC) äquivalente Glucosemenge (HPLC) von der Glucosemenge (Term Z) vor jeder weiteren Berechnung abzuziehen.

   2. Gehalt an Saccharose/Invertzucker/Isoglucose

      (berechnet als Saccharose und bezogen auf die Ware)

      1. S + (2F) × 0,95,

         wenn der Glucosegehalt in der Ware gleich hoch oder höher ist als der Fructosegehalt;

      2. S + (G + F) × 0,95,

         wenn der Glucosegehalt niedriger ist als der Fructosegehalt.

      In den Formeln bedeuten:
      S = Saccharosegehalt in der Ware, bestimmt mittels HPLC;
      F = Fructosegehalt in der Ware, bestimmt mittels HPLC;
      G = Glucosegehalt in der Ware, bestimmt mittels HPLC.

      Wenn hydrolysierte Lactose als Bestandteil der Ware angemeldet und/oder Lactose und Galactose neben anderen Zuckern festgestellt werden, so ist die der Galactosemenge (HPLC) äquivalente Glucosemenge (HPLC) von der Glucosemenge (Term G) vor jeder weiteren Berechnung abzuziehen.

   3. Gehalt an Milchfett
      1. Vorbehaltlich der Bestimmungen der Buchstaben b und c wird der Milchfettgehalt der Waren in Gewichtshundertteilen nach vorangegangenem Salzsäureaufschluss ermittelt, wobei als Milchfett die nach diesem Aufschluss mit Petroläther extrahierbaren Stoffe gelten.
      2. Enthält eine Ware nach der Anmeldung neben Milchfett andere Fette und/oder Öle, so ist wie folgt zu verfahren:
         • der Gesamtfettgehalt in Gewichtshundertteilen wird nach den Bestimmungen des Buchstabens a ermittelt;
         • zur Bestimmung des Milchfettgehalts ist eine Extraktion mit Petroläther nach Salzsäureaufschluss, der eine gaschromatographische Analyse der Fettsäuren als Methylester folgt, vorzunehmen. Wird hierbei das Vorhandensein von Milchfett festgestellt, so gilt als Milchfettgehalt der ermittelte Gehalt an Buttersäuremethylester in Gewichtshundertteilen, multipliziert mit dem Faktor 25, wobei der so erhaltene Wert mit der Gesamtfettmenge multipliziert und durch 100 dividiert wird.
      3. Enthält eine Ware, für die nach Teil Zwei und Anhang 1 des Abschnitts I von Teil Drei der Kombinierten Nomenklatur, die in Anhang I der Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 festgelegt ist, ein Agrarteilbetrag erhoben wird, gemäß Anmeldung neben Milchfett andere Fette und/oder Öle und enthält mindestens 30 % Milcheiweiß, das nach Absatz 4 dieses Artikels bestimmt wurde, und gemäß der Angabe des Anmelders weniger als 6 % Milchfett, wird anstelle des Verfahrens nach Buchstabe b das folgende Verfahren angewendet:
         • der Gesamtfettgehalt in Gewichtshundertteilen wird nach den Bestimmungen des Buchstabens a ermittelt;
         • zur Bestimmung des Milchfettgehalts ist eine Extraktion mit Petroläther nach Salzsäureaufschluss, der eine gaschromatographische Analyse der Fettsäuren als Methylester folgt, vorzunehmen. Wird hierbei das Vorhandensein von Milchfett festgestellt, so gilt als Milchfettgehalt der ermittelte Gehalt an Buttersäuremethylester in Gewichtshundertteilen, multipliziert mit dem Faktor 50, wobei der so erhaltene Wert mit der Gesamtfettmenge in Gewichtshundertteilen multipliziert und durch 100 dividiert wird.
   4. Gehalt an Milcheiweiß
      1. Vorbehaltlich der Bestimmungen des Buchstabens b wird zur Ermittlung des Milchproteingehalts der Waren in Gewichtshundertteilen ihr Stickstoffgehalt nach der Kjeldahl-Methode festgestellt. Als Gehalt der Ware an Milchprotein gilt der Gehalt an Stickstoff, multipliziert mit dem Faktor 6,38.
      2. Enthält die Ware nach der Anmeldung neben Milcheiweiß Bestandteile, die anderes Eiweiß als Milcheiweiß enthalten, so ist folgendermaßen zu verfahren:
         • der Gesamtstickstoffgehalt in Gewichtshundertteilen ist nach der Kjeldahl-Methode, wie unter Buchstabe a beschrieben, zu ermitteln;
         • der Gehalt an Milchprotein wird wie unter Buchstabe a beschrieben berechnet, wobei jedoch vor der Multiplikation vom Gesamtstickstoffgehalt in Gewichtshundertteilen der Stickstoffgehalt subtrahiert wird, der von anderem Eiweiß als Milcheiweiß herrührt.

Artikel 3 Einreihung von Waren ¹¹

Zur Anwendung des Anhangs I der Verordnung (EU) Nr. 514/2011 und des Anhangs I der Verordnung (EWG) Nr. 2658/87 sind bei der Einreihung der nachstehenden Waren folgende Verfahrensweisen und Methoden anzuwenden

1. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 0403 10 51 bis 0403 10 59, 0403 10 91 bis 0403 10 99, 0403 90 71 bis 0403 90 79 und 0403 90 91 bis 0403 90 99 ist der Milchfettgehalt der Waren nach den Bestimmungen von Artikel 2 Nummer 3 der vorliegenden Verordnung zu ermitteln.
2. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 1704 10 10 und 1704 10 90 sowie 1905 20 10 bis 1905 20 90 ist der Saccharosegehalt der Waren (einschließlich Invertzucker als Saccharose berechnet) mittels der HPLC-Methode zu ermitteln (als Invertzucker wird die Summe aus Fructose und Glucose bis zur Menge, in der beide Zucker in gleichen Teilen vorhanden sind, multipliziert mit 0,95, berechnet).
3. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 1806 10 15 bis 1806 10 90 ist der Gehalt der Waren an Saccharose/Invertzucker/Isoglucose nach den Formeln, Verfahrensweisen und Methoden von Artikel 2 Nummer 2 der vorliegenden Verordnung zu ermitteln.
4. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 3505 20 10 bis 3505 20 90 ist der Gehalt der Waren an Stärken, Dextrinen oder anderen modifizierten Stärken nach der Methode in Anhang II zu ermitteln.
5. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 3809 10 10 bis 3809 10 90 ist der Gehalt der Waren an Stärke und Stärkederivaten nach der Methode in Anhang II der vorliegenden Verordnung zu ermitteln.
6. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 1901 90 11 und 1901 90 19 ist der Trockenstoffgehalt in Gewichtshundertteilen durch Trocknung bei 103 °C ± 2 °C bis zur Gewichtskonstanz zu bestimmen.
7. Zur Einreihung von Waren der KN-Codes 1902 19 10 und 1902 19 90 werden Weichweizenmehl und Weichweizengrieß in Teigwaren nach der in Anhang III der vorliegenden Verordnung beschriebenen Methode nachgewiesen.
8. Der Gehalt an Mannitol und an D-Glucitol (Sorbit) in Waren der KN-Codes 2905 44 11 bis 2905 44 99 und 3824 60 11 bis 3824 60 99 ist mittels HPLC zu bestimmen.

Artikel 4 Prüfbericht ¹¹

(1) Es ist ein Untersuchungszeugnis anzufertigen.

(2) Das Untersuchungszeugnis muss insbesondere folgende Angaben enthalten:

• alle erforderlichen Angaben, um die Nämlichkeit der Warenprobe sicherzustellen;
• die Bezeichnung des angewandten gemeinschaftlichen Verfahrens unter Angabe der zugrunde liegenden Rechtsvorschrift oder die Angabe des Literaturzitats, dem die genaue Methodenbeschreibung oder das Prinzip eines in dieser Verordnung vorgesehenen Verfahrens entnommen wurde;
• die Vorkommnisse, die das Analysenergebnis beeinflusst haben können;
• die Analysenergebnisse, in der Form dargestellt, wie dies in der Beschreibung des angewandten Verfahrens vorgesehen ist und entsprechend den Bedürfnissen der Zolldienststelle oder jeder anderen Verwaltung, die die Untersuchung veranlasst hat.

Artikel 4a ¹⁵

1. Die Mitgliedstaaten übermitteln der Kommission bis zum 17. Dezember 2017 Informationen über die Ergebnisse der Analysen gemäß den in Artikel 2 Absätze 3 und 4 festgelegten Verfahren, die bei Waren mit einem nach Artikel 2 Absatz 4 bestimmten Milcheiweißgehalt von mindestens 30 % durchgeführt wurden, die zwischen dem 17. Juni 2015 und dem 17. Juni 2017 beim Zoll angemeldet wurden.
2. Die in Absatz 1 genannten Informationen sind in elektronischer Form zu übermitteln und enthalten folgende Angaben:
   1. Datum der Annahme der Zollanmeldung;
   2. Menge der betreffenden Waren;
   3. Zolltarifliche Einreihung der betreffenden Waren;
   4. den zusätzlichen angemeldeten Code und bei Waren, bei denen die Analysemethode nach Artikel 2 Absatz 3 Buchstabe c angewendet wurde, den zusätzlichen Code, der auf Grundlage der Ergebnisse dieser Methode anwendbar ist;
   5. anhand der Analysemethode nach Artikel 2 Absatz 4 ermittelter Milcheiweißgehalt;
   6. Analysemethode für die Ermittlung des Milchfettgehalts nach Artikel 2 Absatz 3;
   7. anhand der Analysemethode nach Artikel 2 Absatz 3 Buchstabe a ermittelter Gesamtfettgehalt;
   8. anhand einer der Analysemethoden nach Artikel 2 Absatz 3 ermittelter Milchfettgehalt;
   9. gegebenenfalls die Art der anderen Fette und/oder Öle, die neben Milchfett im landwirtschaftlichen Verarbeitungserzeugnis enthalten sind.
3. Auf der Grundlage der von den Mitgliedstaaten nach den Absätzen 1 und 2 vorgelegten Informationen legt die Kommission den Mitgliedstaaten einen Bericht über das Funktionieren des Verfahrens nach Artikel 2 Absatz 3 Buchstabe c vor. Die Kommission legt diesen Bericht bis zum 17. Juni 2018 vor.".

Artikel 5 Schlussbestimmung ¹¹

Die Verordnung (EWG) Nr. 4154/87 wird aufgehoben.

Bezugnahmen auf die aufgehobene Verordnung gelten als Bezugnahmen auf die vorliegende Verordnung und sind nach Maßgabe der Entsprechungstabelle in Anhang V zu lesen.

Artikel 6

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 16. September 2008

.

1. Anwendungsbereich

Diese Methode beschreibt die Bestimmung des Gehalts an Stärke und ihren Abbauprodukten, einschließlich Glucose, in Lebensmitteln, nachstehend ,Stärke' genannt. Der Stärkegehalt wird bestimmt durch die quantitative Analyse von Glucose mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) nach enzymatischer Umwandlung der Stärke und ihrer Abbauprodukte in Glucose.

2. Bestimmung des Gesamtglucosegehalts und des Gesamtglucosegehalts, ausgedrückt als Stärke

Der Gesamtglucosegehalt entspricht dem unter Ziffer 7.2.1 berechneten Wert Z. Er steht für den Gehalt an Stärke und allen ihren Abbauprodukten, einschließlich Glucose.

Der Stärke-/Glucosegehalt im Sinne von Anhang III der Verordnung (EG) Nr. 1460/96 wird auf Basis des Gesamtglucosegehalts Z und gemäß Artikel 2 Nummer 1 dieser Verordnung berechnet.

Der in Spalte 3 von Anhang IV der Verordnung (EG) Nr. 1043/2005 der Kommission ¹ angegebene Gehalt an Stärke (oder Dextrinen) wird auf Basis des Gesamtglucosegehalts Z und gemäß Artikel 2 Nummer 2.1 der Verordnung (EG) Nr. 904/2008 der Kommission ² berechnet.

Der unter Ziffer 1 des vorliegenden Anhangs genannte Stärkegehalt entspricht dem gemäß Ziffer 7.2.2 berechneten Wert E. Er wird in % (m/m) ausgedrückt und ist dem Gesamtglucosegehalt Z, ausgedrückt als Stärke, gleichwertig. Der Wert E hat keinen Einfluss auf die oben genannten Berechnungen.

3. Prinzip

Die Proben werden homogenisiert und in Wasser suspendiert. Die Stärke und ihre Abbauprodukte, die in den Proben enthalten sind, werden in zwei Schritten enzymatisch in Glucose umgewandelt:

1. Stärke und ihre Abbauprodukte werden mithilfe von thermostabiler a-Amylase bei 90 °C teilweise in lösliche Glucoseketten gespalten. Damit die Reaktion störungsfrei abläuft, müssen die Proben vollständig aufgelöst sein oder als Suspension mit sehr kleinen Feststoffpartikeln vorliegen.
2. Die löslichen Glucoseketten werden mithilfe von Amyloglucosidase bei 60 °C zu Glucose hydrolysiert.

Produkte mit hohem Protein- oder Fettgehalt werden geklärt und filtriert.

Der Gehalt an Zuckern wird durch HPLC-Analyse bestimmt.

Da es unter Einwirkung der Enzyme zu einer partiellen Inversion von Saccharose kommen kann, werden die freien Zucker zwecks Berechnung des berichtigten Glucosegehalts ebenfalls mittels HPLC-Analyse bestimmt.

4. Reagenzien und Geräte

Zu verwenden sind Reagenzien von anerkannter Analysequalität und entmineralisiertes Wasser.

4.1. Glucose, mindestens 99 %

4.2. Fructose, mindestens 99 %

4.3. Saccharose, mindestens 99 %

4.4. Maltose-Monohydrat, mindestens 99 %

4.5. Lactose-Monohydrat, mindestens 99 %

4.6. Lösung von thermostabiler α-Amylase (1,4-α-D-Glucan-Glucanohydrolase) mit einer Aktivität von etwa 31.000 U/ml (1 U setzt bei pH 6,9 und 20 °C innerhalb von 3 Min. 1,0 mg Maltose aus Stärke frei). Dieses Enzym kann eine geringe Menge an Verunreinigungen (z.B. Glucose oder Saccharose) und anderen störenden Enzymen enthalten. Lagerung bei etwa 4 °C. Alternativ kann auch a-Amylase aus anderen Quellen verwendet werden, die eine Lösung mit vergleichbarer Enzymaktivität ergibt.

4.7. Amyloglucosidase (1,4-α-D-Glucan-Glucohydrolase) aus Aspergillus niger, Pulver mit einer Aktivität von etwa 120 U/mg oder etwa 70 U/mg (1 U setzt bei pH 4,8 und 60 °C pro Minute 1 Mikromol Glucose aus Stärke frei). Dieses Enzym kann eine geringe Menge an Verunreinigungen (z.B. Glucose oder Saccharose) und anderen störenden Enzymen (z.B. Invertase) enthalten. Lagerung bei etwa 4 °C. Alternativ kann auch Amyloglucosidase aus anderen Quellen verwendet werden, die eine Lösung mit vergleichbarer Enzymaktivität ergibt.

4.8. Zinkacetatdihydrat, p. a.

4.9. Kaliumhexacyanoferrat(II), (K₄[Fe(CN)]₆.3H₂O), reinst

4.10. Natriumacetat wasserfrei, p. a..

4.11. Essigsäure (Eisessig), 96 % (v/v)

4.12. Natriumacetatpuffer (0,2 mol/l). 16,4 g Natriumacetat (4.10) werden in ein Becherglas eingewogen, in Wasser aufgelöst und in einen 1.000-ml-Messkolben überführt. Die Lösung wird bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt und der pH-Wert mit Essigsäure auf 4,7 eingestellt (mithilfe eines pH-Meters (5.7)). Diese Lösung ist bei 4 °C maximal 6 Monate haltbar.

4.13. Amyloglucosidaselösung. Aus dem Amyloglucosidasepulver (4.7) wird mithilfe des Natriumacetatpuffers (4.12) eine Lösung hergestellt. Die Enzymaktivität muss ausreichend hoch und auf den Stärkegehalt der Probe abgestimmt sein. (Beispiel: Eine Aktivität von 600 U/ml wird erzielt durch 0,5 g Amyloglucosidasepulver 120 U/mg (4.7) in einem Endvolumen von 100 ml für 1 g Stärke in der Probe). Die Lösung muss immer frisch angesetzt werden.

4.14. Referenzlösungen. Für die HPLC-Analyse der Zucker werden die üblicherweise verwendeten Lösungen von Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose und Lactose in Wasser hergestellt.

4.15. Klärungsreagenz (Carrez I). 219,5 g Zinkacetat (4.8) werden in einem Becherglas in Wasser aufgelöst. Die Lösung wird in einen 1 000-ml-Messkolben überführt und mit 30 ml Essigsäure versetzt (4.11). Nach gründlichem Mischen wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate haltbar. Es können auch andere, der Carrez-Lösung äquivalente Klärungsreagenzien verwendet werden.

4.16. Klärungsreagenz (Carrez II). 106,0 g Kaliumhexacyanoferrat (II) (4.9) werden in einem Becherglas in Wasser aufgelöst und in einen 1.000-ml-Messkolben überführt. Die Lösung wird gründlich gemischt und mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate haltbar. Es können auch andere, der Carrez-Lösung äquivalente Klärungsreagenzien verwendet werden.

4.17. Mobile Phase für die HPLC: Es wird das üblicherweise bei der HPLC-Analyse von Zuckern gebräuchliche Fließmittel hergestellt. Bei Verwendung einer Aminopropylkieselgelsäule z.B. dient als mobile Phase in der Regel eine Mischung aus HPLC-Wasser und Acetonitril.

5. Geräte

5.1. Standardlaborglasgeräte

5.2. Faltenfilter, z.B. 185 mm

5.3. Spritzenfilter, 0,45 µm, für wässrige Lösungen geeignet

5.4. Probengläschen, geeignet für HPLC-Probengeber

5.5. Messkolben, 100 ml

5.6. Kunststoffspritzen, 10 ml

5.7. pH-Meter

5.8. Analysenwaage

5.9. Wasserbad mit Thermostat, einstellbar auf 60 °C und 90 °C.

5.10. Für die Analyse von Zuckern geeignete HPLC-Anlage.

6. Verfahren

6.1. Vorbereitung der Probe für verschiedene Produktarten

Das Produkt wird homogenisiert.

6.2. Probeneinwaage

Die Probeneinwaage wird anhand der Zutatenliste und der Bedingungen der HPLC-Analyse (Konzentration der Glucosereferenzlösung) geschätzt und beträgt höchstens:

Die Probe wird auf 0,1 mg genau eingewogen.

6.3. Blindwert

Für die Bestimmung des Blindwerts wird eine vollständige Analyse (wie unter 6.4 beschrieben) ohne Zugabe einer Probe durchgeführt. Das Ergebnis der Blindprobe wird zur Berechnung des Stärkegehalts verwendet (7.2).

6.4. Analyse

6.4.1. Vorbereitung der Proben

Die Proben werden durch Schütteln oder Rühren homogenisiert. Die Probe wird in einen Messkolben (5.5) eingewogen (6.2) und mit etwa 70 ml warmem Wasser versetzt.

Nach Zugabe von 50 Mikroliter thermostabiler a-Amylase (4.6) wird die Lösung oder Suspension 30 Min. bei 90 °C im Wasserbad (5.9) erhitzt. Anschließend wird sie so schnell wie möglich im Wasserbad auf 60 °C abgekühlt und mit 5 ml Amyloglucosidaselösung (4.13) versetzt. Bei Probenmatrices, die den pH-Wert der Reaktionslösung beeinflussen könnten, wird der pH-Wert überprüft und erforderlichenfalls auf 4,6 bis 4,8 eingestellt. Man lässt die Proben 60 Min. bei 60 °C reagieren und kühlt sie anschließend auf Raumtemperatur ab.

6.4.2. Klärung

Für Proben mit einem hohen Protein- oder Fettgehalt ist eine Carrez-Klärung erforderlich. Nach Zugabe von 1 ml Carrez I (4.15) wird die Probelösung geschüttelt und mit 1 ml Carrez II (4.16) versetzt. Die Probe wird nochmals geschüttelt.

6.4.3. Vorbereitung für die HPLC-Analyse

Die Probe im Messkolben wird bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt, geschüttelt und durch ein Faltenfilter (5.2) filtriert. Das Filtrat wird aufgefangen.

Die Probenfiltrate werden mit einer Spritze (5.6), die mit dem jeweiligen Filtrat vorgespült wurde, durch ein Spritzenfilter (5.3) filtriert. Diese Filtrate werden in Probegläsern (5.4) aufgefangen.

6.5. Chromatografie

Die HPLC wird wie bei der Analyse von Zuckern üblich durchgeführt. Sollte die Analyse Spuren von Maltose ergeben, so ist die Stärke unvollständig abgebaut, was zu einem zu niedrigen Wert für Glucose führt.

7. Berechnung und Darstellung der Ergebnisse

7.1. Berechnung der HPLC-Ergebnisse

Für die Berechnung des Stärkegehalts werden die Ergebnisse von zwei HPLC-Analysen benötigt, nämlich die der Zucker, die vor der Enzymbehandlung in der Probe enthalten sind (,freie Zucker'), und die der Zucker, die nach der Enzymbehandlung (wie in dieser Methode beschrieben) enthalten sind. Außerdem ist eine Blindwertbestimmung durchzuführen, damit das Ergebnis um die in den Enzymen enthaltenen Zucker korrigiert werden kann.

Bei der HPLC-Analyse wird die Peak-Fläche nach der Integration bestimmt, und die Konzentration wird nach Kalibrierung mit den Referenzlösungen (4.14) berechnet. Die bei der Blindwertbestimmung ermittelte Glucosekonzentration (g/100 ml) wird von der Glucosekonzentration (g/100 ml) nach Enzymbehandlung abgezogen. Schließlich wird der Zuckergehalt (g Zucker/100 g Probe) unter Zugrundelegung der Probeneinwaage berechnet, was zu folgenden Ergebnissen führt:

1. Die HPLC-Analyse vor der Enzymbehandlung ergibt den Gehalt (g/100 g) an freien Zuckern:
   • Glucose G
   • Fructose F
   • Saccharose S
2. Die HPLC-Analyse nach der Enzymbehandlung ergibt den Gehalt (g/100 g) an Zuckern:
   • Glucose nach Berichtigung um den Blindwert (G_{e cor})
   • Fructose Fe
   • Saccharose Se

7.2. Berechnung des Stärkegehalts

7.2.1. Berechnung der Gesamtglucose ,Z'

Ist die Fructosemenge nach der Enzymbehandlung (Fe) höher als die Fructosemenge vor der Enzymbehandlung (F), wurde die in der Probe vorhandene Saccharose teilweise in Fructose und Glucose invertiert. Das bedeutet, dass eine Berichtigung um die freigesetzte Glucose vorgenommen werden muss (F_e - F).

Z, endgültiger Glucosegehalt nach Berichtigung in g/100 g:

Z = (G_{e cor}) - (F_e - F)

7.2.2. Berechnung des Gesamtglucosegehalts, ausgedrückt als Stärke

E, ,Stärke'-Gehalt in g/100 g:

E = [(G_{e cor}) - (F_e - F)] × 0,9

8. Präzision

In diesem Abschnitt werden die Ergebnisse einer Laborvergleichsuntersuchung an zwei Proben erläutert, bei der Präzisionsdaten zu der Methode ermittelt wurden. Die Präzisionsdaten spiegeln die Leistungsanforderungen an die im vorliegenden Anhang beschriebene Methode wider.

Ergebnisse eines Laborvergleichstests (zur Information)

2008 wurde eine Laborvergleichsstudie durchgeführt, an der die europäischen Zolllabore teilnahmen.

Die Ermittlung der Präzisionsdaten erfolgte nach dem ,Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies', W. Horwitz (IUPAC technical report), Pure & Appl. Chem., Vol. 67, No2, PP.331-343, 1995.

Die Präzisionsdaten sind in der nachstehenden Tabelle angegeben.

_____
1) ABl. Nr. L 172 vom 05.07.2005 S. 24.

2) ABl. Nr. L 249 vom 18.09.2008 S. 9.

.

I. Prinzip der Methode

Durch Säurehydrolyse wird die Stärke in reduzierende Zucker zerlegt, die volumetrisch mit Fehling-Lösung bestimmt werden.

II. Geräte und Reagenzien

1. Kolben von ungefähr 250 ml Fassungsvermögen;
2. Messkolben von 200 ml Fassungsvermögen;
3. Bürette von 25 ml Fassungsvermögen;
4. Salzsäure, Dichte 1,19 g/cm³;
5. wässrige Kalilauge;
6. Aktivkohle;
7. Fehling-I- und Fehling-II-Lösung;
8. wässrige Methylenblaulösung 1 % mas.

III. Versuchsdurchführung

In einem Kolben von ungefähr 250 ml Fassungsvermögen wird eine etwa 1 g Stärke enthaltende Probemenge eingewogen und 100 ml destilliertes Wasser sowie 2 ml Salzsäure zugefügt. Die Mischung wird 3 Stunden unter Rückfluss gekocht.

Nach dem Abkühlen wird der Inhalt des Kolbens quantitativ in einen Messkolben mit einem Fassungsvermögen von 200 ml gespült und soviel Kalilauge zugefügt, dass die Lösung nur noch schwach sauer reagiert. Nun wird mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt und zum Entfärben durch etwas Aktivkohle filtriert.

Mit dieser Lösung wird sodann eine Bürette gefüllt und 10 ml Fehling-Lösung wie folgt reduziert:

In einen Stehkolben von etwa 250 ml Fassungsvermögen werden 10 ml Fehling-Lösung (5 ml Lösung A und 5 ml Lösung B) gegeben. Man schüttelt, bis eine klare Lösung entsteht, und fügt sodann 40 ml destilliertes Wasser und eine geringe Menge Quarz oder Siedesteinchen hinzu.

Der Kolben wird auf eine quadratförmige Platte aus geeignetem Material gesetzt, die in der Mitte eine kreisförmige Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 6 cm aufweist. Diese Platte wird wiederum auf ein Drahtnetz gelegt. Der Kolben ist nunmehr so zu erhitzen, dass die Flüssigkeit in etwa 2 Minuten zu sieden beginnt.

Der siedenden Flüssigkeit wird jetzt aus der Bürette so viel von der Zuckerlösung zugegeben, bis die blaue Farbe der Fehling-Lösung kaum noch wahrnehmbar ist. Es werden nun 2 bis 3 Tropfen Methylenblaulösung als Indikator zugesetzt und die Titration durch weiteren tropfenweisen Zusatz der Zuckerlösung fortgesetzt, bis die blaue Farbe des Indikators verschwindet.

Zwecks größerer Genauigkeit wird die Titration unter den gleichen Bedingungen wiederholt, wobei jedoch fast die gesamte Zuckerlösung, die zum Reduzieren der Fehling-Lösung erforderlich ist, auf einmal zugesetzt wird. Bei dieser Titration muss die Fehling-Lösung in 3 Minuten vollständig reduziert sein. Man erhitzt genau weitere 2 Minuten zum Sieden und titriert dann tropfenweise unter Sieden innerhalb 1 Minute bis zum Endpunkt.

Der Gehalt der Probe an Stärke in Gewichtshundertteilen wird nach folgender Formel berechnet:

Stärke in v. H. = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

Hierbei bedeutet:
T = die Menge in g an wasserfreier Glucose, die 10 ml Fehling-Lösung entsprechen. 10 ml Fehling-Lösung (5 ml Lösung A und 5 ml Lösung B) entsprechen 0,04945 g wasserfreier Glucose, wenn Lösung I 17,636 g Kupfer je Liter enthält;
n = die bei der Titration verbrauchte Menge an Zuckerlösung in ml;
p = die Einwaage;
0,95 = der Faktor zur Umrechnung von wasserfreier Glucose in Stärke.

IV. Herstellung der Fehling-Lösungen

In einem Messkolben werden 69,278 g kristallisiertes, analysenreines, eisenfreies Kupfersulfat (CuSO₄ 5H₂O) in destilliertem Wasser zu 1 Liter gelöst. Der genaue Titer der Lösung ist durch eine quantitative Bestimmung des Kupfers festzustellen.

Lösung B: In einem Messkolben werden 100 g Natriumhydroxyd und 346 g Kaliumnatriumtartrat (Seignettesalz) in destilliertem Wasser zu 1 Liter gelöst.

Die beiden Lösungen A und B sind zu gleichen Teilen unmittelbar vor der Verwendung zu mischen. 10 ml Fehling-Lösung (5 ml Lösung A und 5 ml Lösung B) werden durch 0,04945 g wasserfreie Glucose vollständig reduziert, wenn wie unter III beschrieben verfahren wird.

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I. Prinzip der Methode

Von der Teigwarenprobe wird unter Verwendung eines nichtpolaren Lösungsmittels ein Auszug gewonnen.

Dieser Auszug wird auf einer Kieselgeldünnschicht chromatographiert. Hierdurch werden die vorhandenen Sterine in verschiedene streifenförmige Fraktionen zerlegt.

Aus der Zahl der intensiven Farbstreifen kann geschlossen werden, ob die Teigware nur aus Hart- oder Weichweizen oder aus einer Mischung von Hart- und Weichweizen hergestellt worden ist. Ferner kann festgestellt werden, ob bei der Herstellung der Teigwaren Eier verwendet worden sind.

II. Geräte und Reagenzien

1. Homogenisator oder Laboratoriumsmühle, um ein Mahlgut zu erreichen, das ein Sieb mit Maschenweite 0,200 mm passiert;
2. genormtes Sieb mit einer Maschenweite von 0,200 mm;
3. Vakuum-Eindampfgerät mit Wasserbad;
4. Glasplatte, Aluminiumfolien oder andere geeignete Träger im Format 20 × 20 cm mit Kieselgeldünnschicht. Wird die Kieselgeldünnschicht selbst hergestellt, so wird eine Kieselgel-Gips-Mischung mit einem Gipsgehalt von etwa 13 v. H. verwendet. Die Schicht wird unter Befolgung der Angaben des Herstellers mit einem geeigneten Gerät aufgebracht. Sie soll 0,25 mm dick sein;
5. Mikropipette zum Abmessen von 20 Mikrolitern;
6. Gefäß mit Deckel für die Entwicklung der Chromatogramme;
7. Sprühgerät;
8. Petroläther mit einem Siedebereich von 40 °C bis 60 °C, vor Gebrauch frischdestilliert;
9. Diethylether, wasserfrei, zur Analyse;
10. Tetrachlorkohlenstoff, für die Chromatographie, vor Gebrauch frisch destilliert;
11. Molybdatophosphorsäure, zur Analyse;
12. Ethylalkohol, 94 % vol.

III. Versuchsdurchführung

Etwa 20 g der Probe werden so fein gemahlen, dass sie das Sieb vollständig passieren. Die zerkleinerte Probe wird in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, mit 150 ml Petroläther bedeckt und bis zum nächsten Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Kolben ist dabei von Zeit zu Zeit zu schütteln.

Danach wird die Mischung durch einen Büchner-Trichter mit Filtrierschicht oder durch ein Faltenfilter filtriert. Das klare Filtrat wird portionsweise in einen 100-ml-Kolben übergeführt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei 40 °C bis 50 °C Wasserbadtemperatur verdampft. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird das Erwärmen unter vermindertem Druck noch etwa 10 Minuten fortgesetzt.

Nach Abkühlen des Kolbens wird das Gewicht des erhaltenen Auszugs bestimmt. Der Auszug wird sodann in Diethylether gelöst, wobei je 60 mg Auszug 1 ml Diethylether zu verwenden ist.

Die Kieselgeldünnschichten werden durch dreistündiges Erwärmen bei 130 °C aktiviert. Man lässt sie im Exsikkator über Kieselgel abkühlen. Nicht sofort verwendete Platten werden im Exsikkator belassen.

Auf eine möglichst frisch aktivierte Schicht werden 20 Mikroliter der klaren Lösung in Form eines aus nebeneinander liegenden Tröpfchen bestehenden gleichbleibenden Streifens von 3 cm Länge aufgebracht, worauf man das Lösungsmittel verdampfen lässt.

Das Chromatogramm wird bei Zimmertemperatur mit Tetrachlorkohlenstoff in einem Chromatographiergefäß entwickelt, dessen Wände mit Filterpapier bedeckt werden, welches das Laufmittel enthält. Nach etwa einer Stunde hat das Lösungsmittel eine Höhe von 18 cm erreicht. Man nimmt die Platte heraus und lässt das Laufmittel an der Luft verdunsten. Das Chromatogramm wird alsdann ein zweites Mal entwickelt, damit die Streifen besser getrennt werden. Das Laufmittel lässt man wieder an der Luft verdunsten.

Die Kieselgeldünnschicht wird nunmehr mit einer Lösung von Molybdatophosphorsäure in 20 % mas Ethylalkohol besprüht. Die Farbe der Schicht muss gleichmäßig gelb sein. Durch anschließendes 5 Minuten langes Erwärmen auf 110 °C werden die Streifen sichtbar gemacht.

IV. Auswertung des Chromatogramms

Weist das Chromatogramm einen einzigen kräftigen Hauptstreifen mit einem Rf-Wert von etwa 0,4 bis 0,5 auf, so ist zur Herstellung der Teigwaren Hartweizen verwendet worden. Zeigen sich dagegen zwei Hauptstreifen von gleicher Intensität, ist der verwendete Rohstoff Weichweizen. Mischungen von Hart- und Weichweizen können durch die unterschiedliche Intensität der beiden Streifen erkannt werden.

Stellt man auf dem Chromatogramm drei Streifen fest (zwei Streifen in Höhe der Hauptstreifen des Weichweizens sowie einen dazwischen liegenden Streifen), so weist dies auf einen Eigehalt der Teigware hin. Wenn in diesem Fall der obere Streifen schwächer ist als der Zwischenstreifen, diente als Rohstoff Hartweizen. Ist der obere Streifen dagegen ausgeprägter als der Zwischenstreifen, so ist Weichweizen verwendet worden.

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Verordnung (EWG) Nr. 4154/87 der Kommission (ABl. Nr. L 392 vom 31.12.1987 S. 19)

Verordnung (EG) Nr. 203/98 der Kommission (ABl. Nr. L 21 vom 28.01.1998 S. 6)

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ENDE