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| Methoden zur Bestimmung der Toxizität
B.19 In vitro - Schwesterchromatidaustausch-Test | Anhang V zur RL 67/548/EWG |
B.19.1. Methode
B.19.1.1. Einleitung
Siehe allgemeine Einleitung - Teil B.
B.19.1.2. Definitionen
Siehe allgemeine Einleitung - Teil B; B
B.19.1.3. Bezugssubstanzen
Keine.
B.19.1.4. Prinzip der Methode
Bei dem Schwesterchromatidaustausch - (SCE = Sister Chromatid Exchange) - Test handelt es sich um einen Kurzzeittest zur Ermittlung reziproker Austausche der DNS zwischen zwei Schwesterchromatiden eines sich replizierenden Chromosoms. SCE stellt den Austausch von DNS-Replikationsprodukten an anscheinend homologen Loci dar. Der Austauschprozeß umfaßt vermutlich Bruch und Reunion der DNS-Stränge, aber über seine Molekulargrundlage ist wenig bekannt. Zur Erkennung des SCE ist es erforderlich, die Schwesterchromatiden unterschiedlich zu markieren, was sich durch Einbau von Bromdesoxyuridin (BrdU) in die Chromosomen-DNS während eines oder zwei Zellzyklen erreichen läßt.
Die Säugetierzellen werden in vitro mit und ohne Zusatz eines exogenen Säuger-Metabolisierungssystems mit der Prüfsubstanz behandelt und während eines oder zweier Replikationszyklen in BrdU enthaltendem Medium kultiviert. Nach Behandlung mit einem Spindelgift (z.B. Colchicin) zur Akkumulierung der Zellen in einem metaphasenähnlichen Stadium der Mitose (C-Meraphase) werden die Zellen gewonnen und Chromosomenpräparationen hergestellt.
B.19.1.5. Qualitätskriterien
Keine.
B.19.1.6. Beschreibung der Methode
Vorbereitung
Versuchsbedingungen
Anzahl der Kulturen
Für jeden experimentellen Punkt sind mindestens zwei Kulturen zu verwenden.
Verwendung von Positiv- und Negativkontrollen
Bei jedem Versuch sind Positivkontrollen heranzuziehen sowohl unter Verwendung einer direkt wirksamen Substanz als auch einer Substanz, die eine Stoffwechselaktivierung erfordert. Auch eine Lösungsmittelkontrolle ist zu verwenden.
Folgende Substanzen können beispielsweise als Positivkontrollen verwendet werden:
Gegebenenfalls kann eine zusätzliche Positivkontrolle mit einer Substanz durchgeführt werden, die der gleichen chemischen Klasse angehört wie die Prüfsubstanz.
Konzentrationen
Es sind mindestens drei geeignete Konzentrationen der Prüfsubstanz zu verwenden. Die höchste Konzentration sollte eine signifikant toxische Wirkung ausüben, muß jedoch noch eine adäquate Zellreplikation zulassen. Relativ wasserunlösliche Substanzen sind mit geeigneten Verfahren bis zur Löslichkeitsgrenze zu testen. Bei voll wasserlöslichen, nichttoxischen Substanzen ist die höchste Prüfsubstanzkonzentration von Fall zu Fall festzulegen.
Versuchsdurchführung
Vorbereitung der Kulturen
Zellen etablierter Zellinien werden aus Stammkulturen isoliert (z.B. durch Trypsinierung bzw. Abschütteln), in Kulturgefäße in geeigneter Dichte ausgesät und bei 37 °C inkubiert.
Bei einschichtigen Kulturen ist die Anzahl der Zellen pro Kulturgefäß so zu wählen, daß die Kulturen zum Zeitpunkt der Aufarbeitung zu nicht viel mehr als 50 % konfluent sind. Die Zellen können auch in einer Suspensionskultur gehalten werden. Kulturen von menschlichen Lymphozyten werden unter Verwendung geeigneter Verfahren mit heparinisiertem Blut angelegt und bei 37 °C inkubiert.
Behandlung
Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase werden während einer angemessenen Zeitdauer mit der Prüfsubstanz behandelt. In den meisten Fällen reichen ein bis zwei Stunden aus, doch kann die Behandlungszeit in bestimmten Fällen auf maximal zwei vollständige Zellzyklen verlängert werden. Zellen ohne ausreichende Stoffwechselaktivität sind sowohl mit als auch ohne Zugabe eines geeigneten Metabolisierungssystems mit der Prüfsubstanz zu behandeln. Nach Ende der Behandlungszeit wird durch Waschen der Zellen die Prüfsubstanz entfernt. Die Zellen werden während eines oder zweier Replikationszyklen in Anwesenheit von BrdU kultiviert. Alternativ kann die Behandlung der Zellen während der gesamten Kultivierungszeit von zwei Zellzyklen mit der Prüfsubstanz und BrdU gleichzeitig erfolgen.
Kulturen von menschlichen Lymphozyten werden behandelt, während sie sich in semisynchronem Zustand befinden.
Die Aufarbeitung der Zellen erfolgt zum Zeitpunkt ihrer zweiten Teilung nach der Behandlung, wobei sicherzustellen ist, daß die empfindlichsten Stadien des Zellzyklus mit der Substanz behandelt wurden. An allen Kulturen, denen BrdU beigegeben wurde, sind die entsprechenden Verrichtungen bis zur Gewinnung der Zellen im Dunkeln oder bei entsprechend schwacher Beleuchtung vorzunehmen, um die Photolyse von BrdU-haltiger DNS so gering wie möglich zu halten.
Gewinnung der Zellen
Ein bis vier Stunden vor der Aufarbeitung werden die Zellkulturen mit einem Spindelgift (z.B. Colchicin) behandelt. Jede Kultur wird einzeln gewonnen und getrennt zur Chromosomenpräparation aufgearbeitet.
Präparation und Färbung von Chromosomen
Die Chromosomenpräparate werden mit zytogenetischen Standardverfahren angefertigt. Die Färbung der Objektträger zur Darstellung der SCE ist mit verschiedenen Verfahren möglich (z.B. dem FluoreszensplusGiemsa-Verfahren).
Analyse
Die Anzahl der zu analysierenden Zellen ist unabhängig von der spontanen SCE-Häufigkeit. Normalerweise werden die SCE in mindestens 25 gut gespreiteten Metaphasen pro Kultur gezählt. Vor der Auswertung werden die Objektträger kodiert. Bei Verwendung menschlicher Lymphozyten wertet man nur die Metaphasen mit 46 Zentromeren aus. Bei Verwendung etablierter Zellinien werden nur Metaphasen ausgewertet, deren Zentromerzahl dem häufigsten Wert ± 2 entspricht. Er ist anzugeben, ob Farbsprünge im Zentromerbereich als SCE gezählt wurden oder nicht. Alle Ergebnisse sind in einem unabhängigen Versuch zu bestätigen.
B.19.2. Daten
Die Daten sind in tabellarischer Form darzustellen. Für alle behandelten und Kontrollkulturen sind die SCE-Anzahl pro Metaphase und die SCE-Anzahl pro Chromosom für jede Kultur getrennt anzugeben.
Die Auswertung der Daten sollte unter Verwendung geeigneter statistischer Verfahren erfolgen.
B.19.3. Abschlußbericht
B.19.3.1. Prüfbericht
Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:
B.19.3.2. Interpretation
Siehe allgemeine Einleitung Teil B.
B.19.4. Literatur
Siehe allgemeine Einleitung Teil B; H
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