1. Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 476 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese überarbeitete Fassung der Prüfmethode B.17 beruht auf fast 30-jähriger Erfahrung mit dieser Prüfung sowie auf der Entwicklung einer eigenen neuen Methode für Invitro-Genmutationsprüfungen an Säugetierzellen anhand des Thymidin-Kinase-Gens. Sie ist Teil einer Reihe von Prüfmethoden zur genetischen Toxikologie. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).

2. Die Invitro-Genmutationsprüfung an Säugetierzellen wird zum Nachweis von chemisch induzierten Genmutationen verwendet. Mit den bei dieser Prüfung verwendeten Zelllinien werden Vorwärtsmutationen in Reporter-Genen gemessen, insbesondere im endogenen Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (Hprt bei Zelllinien von Nagern und HPRT bei menschlichen Zellen, bei dieser Prüfmethode gemeinsam als Hprt-Gen und als HPRT-Prüfung bezeichnet) und im Transgen von Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (gpt) (im Folgenden XPRT-Prüfung genannt). Durch die HPRT- und XPRT-Mutationsprüfung lassen sich unterschiedliche Spektren genetischer Ereignisse ermitteln. Neben den mit der HPRT-Prüfung nachgewiesenen Mutationsereignissen (z.B. Basenpaarsubstitutionen, Rasterverschiebungen, kleine Deletionen und Insertionen) kann die Autosomenlokation des gpt-Transgens den Nachweis von Mutationen infolge umfangreicher Deletionen und u. U. mitotischer Rekombinationen ermöglichen, die in der HPRT-Prüfung nicht erkannt wurden, weil das Hprt-Gen sich auf dem X-Chromosom befindet (2) (3) (4) (5) (6) (7). Aus rechtlichen Gründen ist die XPRT-Prüfung gegenwärtig weniger verbreitet als die HPRT-Prüfung.

3. Es gelten die Begriffsbestimmungen in Anlage 1.

Ausgangsüberlegungen und Begrenzungen

4. In vitro durchgeführte Prüfungen erfordern in der Regel den Zusatz eines exogenen Fremdstoff-Metabolisierungssystems. Mit diesem exogenen Stoffwechselaktivierungssystem lassen sich die Invivo-Bedingungen jedoch nicht gänzlich nachvollziehen.

5. Es sind unbedingt Bedingungen zu vermeiden, die zu künstlich verursachten Positivergebnissen führen könnten (d. h. mögliche Wechselwirkungen mit dem Prüfsystem), die nicht von einer direkten Interaktion zwischen den Prüfchemikalien und dem genetischen Material der Zelle herrühren; zu solchen Bedingungen gehören Veränderungen des pH-Wertes bzw. der Osmolalität (8) (9) (10), eine Interaktion mit einzelnen Komponenten des Mediums (11) (12) oder eine hochgradige Zytotoxizität (13). Zytotoxizitätswerte, die die empfohlenen Höchstwerte nach Nummer 19 überschreiten, werden mit Blick auf die HPRT-Prüfung als zu hoch betrachtet.

6. Bevor die Prüfmethode an einem Gemisch für die Generierung von Daten für einen bestimmten Regulierungszweck verwendet wird, ist zu prüfen, ob sie für den beabsichtigten Zweck angemessene Ergebnisse liefern kann und, wenn dem so ist, warum. Solche Erwägungen entfallen, wenn die Prüfung des Gemischs gesetzlich vorgeschrieben ist.

Prinzip der Prüfmethode

7. Mutierte Zellen, bei denen in der HPRT-Prüfung keine Aktivität des Hprt-Enzyms bzw. in der XPRT-Prüfung keine Aktivität des xprt-Enzyms nachgewiesen wird, sind resistent gegenüber den zytostatischen Wirkungen des purinanalogen 6-Thioguanins (TG). Bei Anwesenheit von Hprt (bei der HPRT-Prüfung) bzw. von gpt (bei der XPRT-Prüfung) sind Zellen hingegen empfindlich gegenüber TG, das die Hemmung des Zellstoffwechsels verursacht und eine weitere Zellteilung verhindert. So können die Mutantenzellen bei Anwesenheit von TG proliferieren, während die normalen Zellen, die das Hprt-Enzym (bei der HPRT-Prüfung) bzw. das gpt-Enzym (bei der XPRT-Prüfung) enthalten, nicht dazu in der Lage sind.

8. Zellen in Suspensions- oder Monoschichtkultur werden über einen angemessenen Zeitraum (3-6 Stunden) mit und ohne exogenes Fremdstoff-Metabolisierungssystem (Nummer 14) mit der Prüfchemikalie behandelt und anschließend subkultiviert, um die Zytotoxizität zu bestimmen und vor der Mutantenselektion die Expression des Phänotyps zu ermöglichen (14) (15) (16) (17). Die Zytotoxizität wird anhand der relativen Überlebensrate (RS). d. h. der Klonierungseffizienz, ermittelt unmittelbar nach der Behandlung und bereinigt um Zellverluste während der Behandlung im Vergleich zur Negativkontrolle bestimmt (Nummer 18 und Anlage 2). Die behandelten Kulturen werden für einen ausreichenden Zeitraum (in der Regel mindestens 7-9 Tage), der für den jeweils gewählten Zelltyp charakteristisch ist, in einem Wachstumsmedium gehalten, um eine annähernd optimale phänotypische Expression der induzierten Mutationen zu ermöglichen. Nach der Expression des Phänotyps wird die Mutantenhäufigkeit bestimmt, indem eine bekannte Anzahl von Zellen auf ein Medium mit dem selektierenden Agens zur Bestimmung der Mutantenkolonien und auf ein Medium ohne selektierendes Agens zur Bestimmung der Klonierungseffizienz (Lebensfähigkeit) aufgeimpft wird. Nach einer geeigneten Inkubationszeit werden die Kolonien gezählt. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien bereinigt um die Klonierungseffizienz bei der Mutantenselektion berechnet.

Beschreibung der Prüfmethode

Vorbereitungen

Zellen

9. Die bei der HPRT- und der XPRT-Prüfung verwendeten Zelltypen sollten nachweislich eine Empfindlichkeit für chemische Mutagene, eine hohe Klonierungseffizienz, einen stabilen Karyotyp und eine geringe Spontanmutationshäufigkeit aufweisen. Für die HPRT-Prüfung werden meist die Zelllinien CHO, CHL und V79 des chinesischen Hamsters, Maus-Lymphomazellen L5178Y und menschliche Lymphoblastoidzellen TK6 verwendet (18) (19). Für die XPRT-Prüfung werden AS52-Zellen (CHO-Zellen) mit dem gpt-Transgen (nach Deletion des Hprt-Gens) verwendet (20) (21); die HPRT-Prüfung kann bei AS52-Zellen nicht durchgeführt werden, weil das Hprt-Gen deletiert wurde. Die Verwendung anderer Zelllinien sollte gerechtfertigt und validiert sein.

10. Zelllinien sind routinemäßig auf Stabilität der modalen Chromosomenzahl und Mycoplasma-Verunreinigung zu überprüfen (22) (23); bei Verunreinigung oder bei veränderter modaler Chromosomenzahl sollten Zellen nicht verwendet werden. Die normale Dauer des Zellzyklus im Prüflabor sollte bekannt sein und mit den veröffentlichten Zelleigenschaften übereinstimmen. Außerdem sollte die Spontanmutationshäufigkeit der Master-Zellenbestände geprüft werden, und bei nicht annehmbarer Mutationshäufigkeit sollten die Bestände nicht verwendet werden.

11. Vor der Verwendung bei dieser Prüfung sind die Kulturen ggf. von bereits vorhandenen Mutantenzellen zu reinigen, z.B. durch Kultivierung im HAT-Medium bei HPRT-Prüfungen und im MPA-Medium bei der XPRT-Prüfung (5) (24) (siehe Anlage 1). Die gereinigten Zellen können kryokonserviert und anschließend zur Verwendung als Arbeitsstämme wieder aufgetaut werden. Nach Erreichen der normalen Verdopplungszeiten können die frisch aufgetauten Arbeitsstämme für die Prüfungen verwendet werden. Bei Durchführung der XPRT-Prüfung sollten bei Routinekulturen von AS52-Zellen Bedingungen hergestellt werden, bei denen die Erhaltung des gpt-Transgens gewährleistet ist (20).

Medien und Kulturbedingungen

12. Die Kultivierung erfordert geeignete Kulturmedien und Inkubationsbedingungen (Kulturgefäße, befeuchtete Atmosphäre mit einer CO₂-Konzentration von 5 % und eine Inkubationstemperatur von 37 °C). Die Zellkulturen sollten immer unter Bedingungen gehalten werden, bei denen das Wachstum in der Log-Phase sichergestellt ist. Vor allem ist für Medien- und Kulturbedingungen zu sorgen, die ein optimales Zellwachstum während der Expressionszeit und eine optimale Klonierungseffizienz der mutierenden und nichtmutierenden Zellen gewährleisten.

Vorbereitung der Kulturen

13. Zelllinien werden aus Stammkulturen gewonnen und im Kulturmedium in einer solchen Dichte überimpft, dass die Zellen in Suspensions- oder Monolayerkultur während der Behandlung und der Expressionszeit weiterhin exponentiell wachsen (z.B. sollte eine Konfluenz bei in Monolayerkultur gezüchteten Zellen vermieden werden).

Stoffwechselaktivierung

14. Bei Zellen mit unzulänglicher endogener Stoffwechselkapazität sollten exogene metabolisierende Systeme verwendet werden. Das gängigste und, sofern nicht anders begründet, standardmäßig empfohlene System, ist eine durch Ko-Faktoren ergänzte postmitochondriale Fraktion (S9) aus der Leber von Nagern (in der Regel Ratten), die mit enzyminduzierenden Agenzien wie Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) oder einer Kombination aus Phenobarbiton und ²-Naphtoflavon (29) (30) (31) (32) vorbehandelt wurde. Das letztgenannte Gemisch verstößt nicht gegen das Stockholmer Übereinkommen über persistente organische Schadstoffe (33) und hat sich bei der Induktion von Mischfunktionsoxidasen als ebenso wirksam wie Aroclor 1254 erwiesen (29) (31). Die S9-Fraktion wird im Endmedium in der Regel in Konzentrationen von 1 bis 2 % v/v verwendet, kann jedoch auf 10 % v/v erhöht werden. Die Wahl der Art und Konzentration des exogenen Metabolisierungssystems oder metabolischen Agens ist möglicherweise von der geprüften Stoffklasse abhängig (34) (35) (36).

Vorbereitung der Prüfchemikalie

15. Feste Prüfchemikalien sollten vor der Zellbehandlung in geeigneten Lösungsmitteln gelöst und ggf. verdünnt werden (Nummer 16). Flüssige Prüfchemikalien können dem Versuchssystem vor der Behandlung direkt beigegeben und/oder verdünnt werden. Gasförmige oder flüchtige Prüfchemikalien sind durch entsprechende Modifikationen der Standardprotokolle zu prüfen, z.B. durch Behandlung in hermetisch verschlossenen Kulturgefäßen (37) (38). Zubereitungen der Prüfchemikalie sollten kurz vor der Behandlung hergestellt werden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen.

Prüfbedingungen

Lösungsmittel

16. Das Lösungsmittel sollte so gewählt werden, dass eine optimale Löslichkeit der Prüfchemikalien gewährleistet ist, ohne dass die Durchführung der Prüfung beeinträchtigt wird, z.B. durch Veränderung des Zellwachstums, Beeinträchtigung der Integrität der Prüfchemikalie, Reaktion mit Kulturgefäßen oder Behinderung des Metabolisierungssystems. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel (oder Kulturmedium) verwendet werden. Gründlich erprobte Lösungsmittel sind z.B. Wasser und Dimethylsulfoxid. Organische Lösungsmittel sollten 1 % v/v und wässrige Lösungsmittel (Kochsalzlösung oder Wasser) 10 % v/v im Endmedium möglichst nicht überschreiten. Kommen weniger gründlich erprobte Lösungsmittel zur Verwendung (z. B Ethanol oder Aceton), ist deren Verwendung durch Daten zu stützen, die belegen, dass sie mit den Prüfchemikalien und mit dem Prüfsystem verträglich und in der verwendeten Konzentration nicht gentoxisch sind. Sind keine entsprechenden Belege verfügbar, sollten unbedingt unbehandelte Kontrollen (siehe Anlage 1) einbezogen werden, um nachzuweisen, dass durch die gewählten Lösungsmittel keine schädlichen oder mutagenen Wirkungen ausgelöst werden.

Messung der Zytotoxizität und Auswahl der Expositionskonzentrationen

17. Bei der Bestimmung der höchsten Konzentration der Prüfchemikalie sind Konzentrationen zu vermeiden, die zu künstlich positiven Reaktionen führen können, z.B. zu übermäßiger Zytotoxizität (Nummer 20), Ausfällungen im Kulturmedium (Nummer 21) oder ausgeprägten Veränderungen des pH-Werts oder der Osmolalität (Nummer 5). Sofern die Prüfchemikalie zum Zeitpunkt der Zugabe den pH-Wert des Mediums erheblich verändert, lässt sich der pH-Wert auch durch Anwendung eines Puffers im Endmedium einstellen, damit künstlich positive Reaktionen vermieden und geeignete Kulturbedingungen aufrechterhalten werden.

18. Die Konzentrationen werden u. a. nach der Zytotoxizität ausgewählt (Nummern 20-22). Wenngleich die Bewertung der Zytotoxizität im Rahmen eines Vorversuchs nützlich sein kann, um eine bessere Bestimmung der im Hauptversuch verwendeten Konzentrationen vornehmen zu können, ist ein Vorversuch nicht erforderlich. Auch wenn die anfängliche Zytotoxizität bewertet wird, ist im Hauptversuch die Zytotoxizität jeder einzelnen Kultur zu messen. Die Zytotoxizität sollte anhand der relativen Überlebensrate (RS) (d. h. der Klonierungseffizienz (CE)) von Zellen ermittelt werden, die nach der Behandlung umgehend plattiert werden; dabei ist eine Bereinigung um Zellverluste während der Behandlung auf der Grundlage der Zellzahl im Vergleich zur bereinigten Klonierungseffizienz bei Negativkontrollen (mit einer Überlebensrate von 100 %) vorzunehmen (Formel siehe Anlage 2).

19. Es sollten mindestens vier Prüfkonzentrationen (ausgenommen das Lösungsmittel und Positivkontrollen) ausgewertet werden, die die Akzeptanzkriterien erfüllen (geeignete Zytotoxizität, Anzahl der Zellen usw.). Die Verwendung von Zweifachkulturen ist zu empfehlen, doch können für jede überprüfte Konzentration auch Replikat- oder Einfachkulturen herangezogen werden. Die Ergebnisse aus den unabhängigen Replikatkulturen bei einer gegebenen Konzentration sollten getrennt angegeben werden, können zu Datenanalysezwecken aber auch gepoolt werden (17). Bei Prüfchemikalien mit geringer Zytotoxizität oder ohne zytotoxische Wirkung sind in der Regel Konzentrationsintervalle mit zwei- bis dreifacher Konzentration geeignet. Wenn zytotoxische Wirkungen auftreten, sollten die Prüfkonzentrationen einen Bereich ausgehend vom Wert, bei dem die Zytotoxizität deutlich wird, bis zu Konzentrationen mit mäßiger oder geringer oder nicht vorhandener Toxizität umfassen. Viele Prüfchemikalien zeigen steile Konzentrations-Wirkungs-Kurven. Um Daten zu mäßiger oder geringer Toxizität zu erhalten oder um die Dosis-Wirkungs-Beziehungen im Einzelnen auszuwerten, kann es daher erforderlich sein, Konzentrationen mit kleineren Abständen und/oder mehr als vier Konzentrationen zu verwenden, insbesondere in Fällen, in denen ein Wiederholungsversuch erforderlich ist (Nummer 43). Die Verwendung von mehr als 4 Konzentrationen kann besonders bei Verwendung von Einfachkulturen wichtig sein.

20. Wenn die Höchstkonzentration auf der Zytotoxizität beruht, sollte bei der Höchstkonzentration eine relative Überlebensrate von 10-20 % erreicht werden. Besondere Sorgfalt ist dann geboten, wenn positive Ergebnisse nur bei relativen Überlebensraten von höchstens 10 % zu verzeichnen sind (Nummer 43).

21. Im Falle schwer löslicher Chemikalien, die bei Konzentrationen unterhalb der niedrigsten unlöslichen Konzentration nicht zytotoxisch sind, sollte die höchste analysierte Konzentration am Ende der Behandlung mit der Prüfchemikalie eine Trübung oder eine mit bloßem Auge oder mithilfe eines Inversmikroskops erkennbare Ausfällung bewirken. Auch wenn die Zytotoxizität oberhalb der niedrigsten unlöslichen Konzentration auftritt, ist es ratsam, nur eine Konzentration zu testen, bei der es zu einer Trübung oder sichtbaren Ausfällung kommt, da künstliche Wirkungen eine Folge dieser Ausfällung sein könnten. Bei der Konzentration, bei der es zu einer Ausfällung kommt, ist unbedingt sicherzustellen, dass die Ausfällung nicht die Durchführung des Versuchs beeinträchtigt. Es ist möglicherweise sinnvoll, die Löslichkeit im Kulturmedium vor dem Versuch zu bestimmen.

22. Wird keine Ausfällung bzw. keine grenzwertige Zytotoxizität beobachtet, sollte die höchste Versuchskonzentration 10 mM, 2 mg/ml oder 2 µl/ml entsprechen, je nachdem, welcher Wert der niedrigere ist (39) (40). Sofern die Zusammensetzung der Prüfchemikalie nicht genau definiert ist, z.B. ein Stoff mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien (UVCB) (41), Umweltextrakte usw., muss die höchste Konzentration möglicherweise höher angesetzt werden (z.B. bei 5 mg/ml), sofern keine ausreichende Zytotoxizität vorhanden ist, um die Konzentration der einzelnen Bestandteile zu erhöhen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass diese Anforderungen sich von denen für Humanpharmazeutika unterscheiden können (42).

Kontrollen

23. Bei allen Versuchsbedingungen sind jeweils gleichzeitige Negativkontrollen (Nummer 16) anzulegen, bei denen das Behandlungsmedium lediglich Lösungsmittel enthält, die ansonsten aber auf die gleiche Weise behandelt wurden wie die Behandlungskulturen.

24. Gleichzeitige Positivkontrollen müssen angelegt werden, um die Eignung des Labors zum Nachweis von Mutagenen unter den Bedingungen des verwendeten Prüfprotokolls sowie ggf. die Wirksamkeit des exogenen Metabolisierungssystems nachzuweisen. Beispiele für Positivkontrollen sind der folgenden Tabelle 1 zu entnehmen. Es können andere geeignete Positivkontrollstoffe verwendet werden, sofern dies begründet ist. Da Invitro-Prüfungen an Säugetierzellen auf genetische Toxizität hinreichend standardisiert sind, können Prüfungen anhand von Behandlungen mit und ohne exogene Stoffwechselaktivierung mit einer einzelnen Positivkontrolle durchgeführt werden, bei der eine Stoffwechselaktivierung erforderlich ist. In diesem Fall wird durch die Reaktion einer einzelnen Positivkontrolle sowohl die Aktivität des Stoffwechselaktivierungssystems als auch die Reaktionsfähigkeit des Prüfsystems nachgewiesen. Jede Positivkontrolle sollte bei einer oder mehreren Konzentrationen durchgeführt werden, die voraussichtlich eine reproduzierbare und erkennbare Zunahme gegenüber dem Hintergrund ergeben, womit sich die Empfindlichkeit des Versuchssystems nachweisen lässt, und die Wirkung sollte nicht durch einen Zytotoxizitätswert beeinträchtigt werden, der die in dieser Prüfmethode vorgegebenen Grenzen überschreitet (Nummer 20).

Tabelle 1: Zur Beurteilung der Eignung des Labors und zur Wahl der Positivkontrollen empfohlene Referenzstoffe

Verfahren

Behandlung mit der Prüfchemikalie

25. Proliferierende Zellen werden mit und ohne Stoffwechselaktivierungssystem mit der Prüfchemikalie behandelt. Die Exposition sollte über einen geeigneten Zeitraum (gewöhnlich 3 bis 6 Stunden) erfolgen.

26. Die Mindestzahl der für jede Prüfung und im jeweiligen Stadium der Prüfung verwendeten Zellen (Kontrolle und behandelte Kultur) sollte auf der Spontanmutationshäufigkeit beruhen. Als Faustregel ist anzunehmen, dass die Anzahl an behandelten Zellen und an Passagen so groß sein muss, dass in jeder einzelnen Kultur und in allen Phasen der Prüfung ständig 10 Spontanmutationen zu verzeichnen sind (17). Die Spontanmutationshäufigkeit liegt in der Regel zwischen 5 und 20 × 10^-6. Um eine hinreichende Anzahl an Spontanmutationen (mindestens 10) bei einer Spontanmutationshäufigkeit von 5 × 10^-6 zu erhalten, müssten selbst bei Kulturen, die mit Konzentrationen behandelt wurden, bei denen sich eine Zytotoxizität von 90 % (relative Überlebensrate 10 %) ergibt, mindestens 20 × 10⁶ Zellen behandelt werden. Außerdem muss während der Expressionszeit eine hinreichende Anzahl an Zellen (mindestens 2 Millionen) kultiviert und zur Mutantenselektion plattiert werden (17).

Expressionszeit des Phänotyps und Messung der Mutationshäufigkeit

27. Nach der Dauer der Behandlung werden die Zellen kultiviert, um die Expression des Mutantenphänotyps zu ermöglichen. Im Allgemeinen sind mindestens 7-9 Tage hinreichend für eine annähernd optimale phänotypische Expression neu induzierter Hprt- und xprt-Mutanten (43) (44). In diesem Zeitraum werden Zellen regelmäßig subkultiviert, um ein exponentielles Wachstum aufrechtzuerhalten. Nach der phänotypischen Expression werden die Zellen im Medium mit und ohne selektierendes Agens (6-Tioguanin) nochmals plattiert, um die Anzahl der Mutanten bzw. die Klonierungseffizienz zum Zeitpunkt der Selektierung zu bestimmen. Diese Plattierung kann mit Schalen für Monoschichtkulturen oder mit Mikrotiterplatten für Zellen in Suspensionskultur vorgenommen werden. Für die Mutantenselektion sollten die Zellen mit einer Dichte plattiert werden, bei der eine optimale Wiederfindung der Mutanten gewährleistet ist (d. h. eine metabolische Kooperation vermieden wird) (17). Die Platten werden über einen angemessenen Zeitraum für ein optimales Koloniewachstum (z.B. 7-12 Tage) inkubiert. Anschließend werden die Kolonien gezählt. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien bereinigt um die Klonierungseffizienz bei der Mutantenselektion berechnet (Formeln siehe Anlage 2).

Kompetenz des Labors

28. Um ausreichende Erfahrungen mit der Prüfung zu sammeln, bevor routinemäßige Prüfungen erfolgen, sollte das Labor eine Reihe von Versuchen mit positiven Referenzstoffen durchgeführt haben, die sich unterschiedlicher Mechanismen (mindestens ein aktiver Mechanismus mit und ein aktiver Mechanismus ohne Stoffwechselaktivierung, ausgewählt aus den in Tabelle 1 aufgeführten Stoffen) und verschiedener Negativkontrollen (unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel/Vehikel) bedienen. Die Reaktionen dieser Positiv- und Negativkontrollen sollten mit der Literatur im Einklang stehen. Dies gilt nicht für erfahrene Labors, d. h. für Labors, die über eine Datenbank mit historischen Daten gemäß der Definition unter den Nummern 30 bis 33 verfügen.

29. Unabhängig davon, ob eine Stoffwechselaktivierung gegeben ist, sollte eine Auswahl von Positivkontrollstoffen (siehe Tabelle 1 in Nummer 25) untersucht werden, um die Fähigkeit zur Erkennung mutagener Chemikalien nachzuweisen und die Wirksamkeit des Stoffwechselaktivierungssystems zu ermitteln und zum einen die Eignung der Bedingungen für das Zellwachstum während der Behandlung sowie für die phänotypische Expression und für die Mutantenselektion und zum anderen die Eignung der Auswertungsverfahren zu belegen. Zum Nachweis der Empfindlichkeit und dynamischen Bandbreite des Versuchssystems sollte eine Spanne der Konzentrationen der ausgewählten Stoffe festgelegt werden, um reproduzierbare und konzentrationsbezogene Zunahmen gegenüber dem Hintergrund zu erhalten.

Historische Kontrolldaten

30. Das Labor sollte Folgendes bestimmen:

• Bereich und Verteilung historischer Positivkontrollen und
• Bereich und Verteilung historischer Negativkontrollen (unbehandelt, Lösungsmittel).

31. Beim erstmaligen Erwerb von Daten zur Verteilung einer historischen Negativkontrolle sollten gleichzeitige Negativkontrollen veröffentlichten Kontrolldaten entsprechen (22). Werden weitere Versuchsdaten zur Verteilung der Kontrollen hinzugefügt, sollten gleichzeitige Negativkontrollen idealerweise innerhalb von 95 % der Kontrollgrenzen der gewählten Verteilung liegen (17) (45) (46).

32. Die Datenbank des Labors zu historischen Negativkontrollen sollte zunächst mit mindestens 10 Versuchen angelegt werden. Vorzugsweise sollte sie jedoch aus mindestens 20 Versuchen bestehen, die unter vergleichbaren Versuchsbedingungen durchgeführt wurden. Labors sollten Qualitätskontrollverfahren anwenden, wie z.B. Qualitätsregelkarten (z.B. C-Karten oder X-Bar-Karten (47)), um zu ermitteln, wie variabel ihre Positiv- und Negativkontrolldaten sind, und um nachzuweisen, dass die Methodik in ihrem Labor kontrolliert wird (46). Weitere Empfehlungen zum Aufbau und zur Verwendung von Sammlungen historischer Daten (d. h. Kriterien für die Aufnahme und den Ausschluss von Daten in bzw. aus historischen Datensätzen und die Akzeptanzkriterien für einen bestimmten Versuch) sind den Literaturangaben zu entnehmen (45).

33. Negativkontrolldaten sollten die Mutantenhäufigkeit aus einer Einzelkultur oder vorzugsweise aus Replikatkulturen erfassen, wie in Nummer 23 beschrieben. Gleichzeitige Negativkontrollen sollten idealerweise innerhalb der Kontrollgrenzen von 95 % der gewählten Verteilung in der Datenbank des Labors zu historischen Negativkontrollen liegen (17) (45) (46). Sofern gleichzeitige Negativkontrolldaten außerhalb der Kontrollgrenzen von 95 % liegen, ist es zulässig, sie in die historische Kontrollverteilung aufzunehmen, solange es sich bei den Daten nicht um "extreme Ausreißer" handelt und nachgewiesen werden kann, dass das Prüfsystem kontrolliert wird (siehe oben) und nachweislich kein technisches oder menschliches Versagen vorliegt.

34. Sämtliche Änderungen am Versuchsprotokoll sind auf ihre Übereinstimmung mit den bereits vorhandenen Datenbanken historischer Kontrolldaten des Labors zu prüfen. Bei größeren Inkonsistenzen sollte eine neue Datenbank historischer Kontrolldaten erstellt werden.

Daten und Berichterstattung

Darstellung der Prüfergebnisse

35. Die Darstellung der Prüfergebnisse sollte sämtliche für die Berechnung der Zytotoxizität (ausgedrückt als relative Überlebensrate) erforderlichen Daten beinhalten. Die Daten für behandelte Kulturen und für Kontrollkulturen sollten die Anzahl der Zellen am Ende der Behandlung, die Anzahl der unmittelbar nach der Behandlung plattierten Zellen und die Koloniezahlen (bzw. bei der Mikrotitermethode die Anzahl der Vertiefungen ohne Kolonien) beinhalten. Die relative Überlebensrate der Kulturen sollten jeweils als Prozentanteil der gleichzeitigen Lösungsmittelkontrolle ausgedrückt werden (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1).

36. Die Darstellung der Prüfergebnisse sollte zudem sämtliche für die Berechnung der Mutantenhäufigkeit erforderlichen Daten beinhalten. Die Daten für behandelte Kulturen und Kontrollkulturen sollten Folgendes umfassen: (1) die Anzahl der mit und ohne selektierendes Agens plattierten Zellen (zum Zeitpunkt der Plattierung der Zellen zur Mutantenselektion) und (2) die ermittelte Koloniezahl (bzw. bei der Mikrotitermethode die Anzahl der Vertiefungen ohne Kolonien) auf den Platten mit und ohne selektierendes Agens. Die Mutantenhäufigkeit wird anhand der Anzahl der Mutantenkolonien (auf den Platten mit dem selektierenden Agens) bereinigt um die Klonierungseffizienz (auf den Platten ohne selektierendes Agens) berechnet. Die Mutantenhäufigkeit sollte als Anzahl der Mutantenzellen pro Million lebensfähiger Zellen ausgedrückt werden (Begriffsbestimmungen siehe Anlage 1).

37. Die Daten der einzelnen Kulturen sind zu dokumentieren. Zusätzlich sollten alle Daten in tabellarischer Form zusammengefasst werden.

Akzeptanzkriterien

38. Die Akzeptanz eines Versuchs beruht auf folgenden Kriterien:

• Die Daten der gleichzeitigen Negativkontrolle gelten als zulässig für die Aufnahme in die Datenbank des Labors mit historischen Negativkontrolldaten (Nummer 33).
• Gleichzeitige Positivkontrollen (Nummer 24) sollten Reaktionen hervorrufen, die mit den Reaktionen kompatibel sind, die in der Datenbank für historische Positivkontrollen erzeugt werden, und, verglichen mit den gleichzeitigen Negativkontrollen, eine statistisch signifikante Zunahme aufweisen.
• Zwei Versuchsbedingungen (d. h. mit und ohne Stoffwechselaktivierung) wurden geprüft, wenn nicht bei einem Versuch positive Ergebnisse ermittelt wurden (Nummer 25).
• Eine angemessene Zahl an Zellen und Konzentrationen ist analysierbar (Nummern 25, 26 und 19).
• Die Kriterien für die Auswahl der höchsten Konzentration entsprechen den Kriterien unter den Nummern 20, 21 und 22.

Beurteilung und Auswertung

39. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn bei einer der getesteten Versuchsbedingungen

• mindestens eine der Versuchskonzentrationen, verglichen mit der gleichzeitigen Negativkontrolle, eine statistisch signifikante Zunahme aufweist,
• ein geeigneter Trendtest zeigt, dass die Zunahme konzentrationsabhängig ist,
• Ergebnisse außerhalb der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten liegen (z.B. Kontrollgrenze von 95 % beruhend auf einer Poisson-Verteilung, siehe Nummer 33).

Sind all diese Kriterien erfüllt, wird davon ausgegangen, dass die Prüfchemikalie in diesem Versuchssystem Genmutationen in Säugerzellkulturen auslösen kann. Für Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden siehe Literaturhinweise (46) (48).

40. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn unter allen untersuchten Versuchsbedingungen

• keine der Versuchskonzentrationen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,
• die Bewertung anhand einer geeigneten Trendprüfung keine konzentrationsabhängige Zunahme ergibt, alle Ergebnisse innerhalb der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten liegen (z.B. Kontrollgrenze von 95 % beruhend auf einer Poisson-Verteilung, siehe Nummer 33).

Es wird dann davon ausgegangen, dass die Prüfchemikalie keine Genmutationen in Säugerzellkulturen in diesem Versuchssystem auslösen kann.

41. Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.

42. In den Fällen, in denen die Reaktion, wie oben beschrieben, weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern, sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen bewertet werden. Die Durchführung eines Wiederholungsversuchs, möglicherweise unter veränderten Versuchsbedingungen (z.B. Abstände der Konzentrationen, andere Metabolisierungsbedingungen (d. h. Konzentration (S9) oder Herkunft (S9)), könnten hilfreich sein.

43. In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen. Daher sollte die Reaktion der Prüfchemikalie als nicht eindeutig eingestuft werden (d. h. für ein positives und für ein negatives Ergebnis besteht die gleiche Wahrscheinlichkeit).

Prüfbericht

44. Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

Prüfchemikalie:

• Herkunft, Chargennummer, ggf. begrenztes Verwendungsdatum;
• Stabilität der Prüfchemikalie, falls bekannt;
• Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel, falls bekannt;
• Messung des pH-Werts, Osmolalität und ggf. Niederschlag im Kulturmedium, dem die Prüfchemikalie zugegeben wurde.

Einkomponentiger Stoff:

• physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
• chemische Bezeichnung, wie z.B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:

• so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

Lösungsmittel:

• Begründung der Auswahl des Lösungsmittels;
• Anteil des Lösungsmittels im endgültigen Kulturmedium.

Zellen:

Bei Labor-Masterkulturen:

• Art, Herkunft der Zelllinien;
• Passagenanzahl (wenn verfügbar) und Laborgeschichte;
• Karyotypmerkmale und/oder Modalzahl der Chromosomen;
• zum Erhalt der Zellkultur verwendete Verfahren;
• Nichtvorhandensein von Mycoplasma;
• Verdopplungszeit der Zellen.

Prüfbedingungen:

• Begründung der Wahl der Konzentrationen und der Anzahl der Kulturen, darunter z.B. Angaben zur Zytotoxizität und Löslichkeitsgrenze;
• Medienzusammensetzung, CO₂-Konzentration, Feuchtigkeit;
• Konzentration der Prüfchemikalie, ausgedrückt als Endkonzentration im Kulturmedium (z.B. µg oder mg/ml oder mM des Kulturmediums);
• Konzentration (und/oder Volumen) des Lösungsmittels und der beigegebenen Prüfchemikalie im Kulturmedium;
• Inkubationstemperatur;
• Inkubationszeit;
• Behandlungsdauer;
• Zelldichte während der Behandlung;
• Art und Zusammensetzung des Stoffwechselaktivierungssystems (Herkunft von S9, Zubereitungsmethode des S9-Gemisches, Konzentration oder Volumen des S9-Gemisches und S9 im Endmedium, Qualitätskontrollen von S9);
• Positiv- und Negativkontrollstoffe, Endkonzentrationen für die jeweiligen Behandlungsbedingungen;
• Dauer der Expressionszeit (ggf. einschließlich Anzahl der überimpften Zellen, Subkulturen und Medienwechsel);
• Bezeichnung und Konzentration des selektierenden Agens;
• Akzeptanzkriterien der Prüfungen;
• Methoden zur Zählung der lebensfähigen und mutierten Zellen;
• Methoden zur Bestimmung der Zytotoxizität;
• evtl. zusätzliche Angaben zur Zytotoxizität und zum verwendeten Verfahren;
• Inkubationszeiten nach dem Plattieren;
• Kriterien zur Einstufung der Studien als positiv, negativ oder nicht eindeutig;
• Methoden zur Bestimmung von pH-Wert, Osmolalität und Ausfällung.

Ergebnisse:

• Anzahl der behandelten Zellen und Anzahl der subkultivierten Zellen der einzelnen Kulturen;
• Bestimmung der Zytotoxizität und ggf. sonstige Beobachtungen;
• Ausfällungszeichen und Bestimmungszeit;
• Anzahl der plattierten Zellen im selektiven und im nicht selektiven Medium;
• Anzahl der Kolonien im nicht selektiven Medium und Anzahl der resistenten Kolonien im selektiven Medium sowie entsprechende Mutantenhäufigkeiten;
• nach Möglichkeit Dosis-Wirkungs-Verhältnis;
• Daten zu gleichzeitigen Negativ-(Lösungsmittel-)Kontrollen und Positivkontrollen (Konzentrationen und Lösungsmittel);
• Daten zu historischen Negativ-(Lösungsmittel-)Kontrollen und Positivkontrollen mit Bereichen, Mittelwerten und Standardabweichungen und Konfidenzintervall (z.B. 95 %) sowie Anzahl der Datensätze;
• statistische Analysen (für einzelne Kulturen und (ggf.) für gepoolte Replikatkulturen) sowie ggf. p-Werte.

Diskussion der Ergebnisse.

Schlussfolgerung

Literatur

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.

(2) Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. und Tindall, K.R. (Hrsg.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3) Chu, E.H.Y. und Malling, H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4) Moore, M.M., Harrington-Brock K., Doerr, C.L. und Dearfield, K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5) Aaron, C.S. und Stankowski, L.F. Jr. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121-128.

(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, L., Theiss, J. und Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, 235-239.

(7) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. und Wasson, J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Genetox Program. Mutation Res., 196, 17-36.

(8) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J. und Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. und Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10) Brusick, D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11) Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I. und Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Acute and longterm effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12) Long, L.H., Kirkland, D., Whitwell, J. und Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13) Kirkland, D., Aardema, M., Henderson, L. und Müller, L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., Loveday, K.S., O'Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. und Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15) Liber, H.L., Yandell, D.W. und Little, J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16) Stankowski, L. F. Jr., Tindall, K. R. und Hsie, A. W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, J., McGregor, D.B. und Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Hrsg.), Cambridge University Press, S. 66-101.

(18) Hsie, A.W., Casciano, D.A., Couch, D.B., Krahn, D.F., O'Neill, J.P. und Whitfield, B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19) Li, A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20) Tindall, K.R., Stankowski, L.F. Jr., Machanoff, R. und Hsie, A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21) Hsie, A. W., Recio, L., Katz, D. S., Lee, C. Q., Wagner, M. und Schenley, R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616-9620.

(22) Lorge, E., Moore, M., Clements, J., Donovan, M. O., Honma, M., Kohara, A., Van Benthem, J., Galloway, S., Armstrong, M.J., Thybaud, V., Gollapudi, B., Aardema, M., Kim, J., Sutter, A., Kirkland, D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuskript in Vorbereitung).

(23) Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O.W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G. und Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24) Rosen, M.P., San, R.H.C. und Stich, H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25) Natarajan, A.T., Tates, A.D, Van Buul, P.P.W., Meijers, M. und de Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N. und Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27) Ames, B.N., McCann, J. und Yamasaki, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28) Maron, D.M. und Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. und Wolf, R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. und Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. und Philpot, R.M. (Hrsg.), Elsevier, North-Holland, S. 85-88.

(31) Ong, T.-M., Mukhtar, M., Wolf, C.R. und Zeiger, E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. und Galloway, S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33) UNEP. (2001). Stockholmer Übereinkommen über persistente organische Schadstoffe, Umweltprogramm der Vereinten Nationen (UNEP). Abrufbar unter: [http://www.pops.int.html].

(34) Tan, E.-L. und Hsie, A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina C³ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35) O'Neill, J.P., Machanoff, R., San Sebastian, J.R., Hsie, A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36) Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37) Krahn, D.F., Barsky, F.C. und McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (Hrsg.). Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, S. 91-103.

(38) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. und Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Acute and longterm effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Mutagen., 5, 795-801.

(39) OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Auf Anfrage erhältlich von der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung.

(40) Brookmire, L., Chen, J.J. und Levy, D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41) EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42) USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Abrufbar unter:[https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43) O'Neill, J.P. und Hsie, A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44) Chiewchanwit, T., Ma, H., El Zein, R., Hallberg, L. und Au, W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.J. und Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation, Res., 723, 87-90.

(46) OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

(47) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., Chanter, D.O. und Phillips, B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Hrsg.) Cambridge University Press, Cambridge, S. 141-154.

(48) Fleiss, J. L., Levin, B. und Paik, M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

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Die Zytotoxizität wird anhand der relativen Überlebensrate ermittelt, d. h. anhand der Klonierungseffizienz (CE) von Zellen, die nach der Behandlung umgehend plattiert werden; dabei ist eine Bereinigung um Zellverluste während der Behandlung im Vergleich zur bereinigten Klonierungseffizienz bei Negativkontrollen (mit einer Überlebensrate von 100 %) vorzunehmen (siehe folgende Formel zur Berechnung der relativen Überlebensrate).

Die bereinigte CE einer mit einer Prüfmethode behandelten Kultur wird wie folgt berechnet:

Die relative Überlebensrate (RS) einer mit einer Prüfmethode behandelten Kultur wird wie folgt berechnet:

Als Mutantenhäufigkeit wird die Klonierungseffizienz von Mutantenkolonien im selektierenden Medium geteilt durch die zum Zeitpunkt der Selektierung in einem nicht selektierenden Medium für dieselbe Kultur ermittelte Klonierungseffizienz bezeichnet.

Verwendung von Platten zur Ermittlung der Klonierungseffizienz:

CE = Anzahl der plattierten Kolonien/Zellen.

Verwendung von Mikrotiterplatten zur Ermittlung der Klonierungseffizienz:

Die Anzahl der Kolonien je Vertiefung auf den Mikrotiterplatten entwickelt sich entsprechend der Poisson-Verteilung.

Klonierungseffizienz = -LnP(0) / Anzahl der pro Vertiefung plattierten Zellen

Wobei -LnP(0) = wahrscheinliche Anzahl leerer überimpfter Vertiefungen; diese Anzahl wird mit der folgenden Formel beschrieben:

LnP(0) = -Ln (Anzahl leerer Vertiefungen / Anzahl plattierter Vertiefungen).

1. Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 478 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese modifizierte Fassung der Prüfmethode beruht auf mehr als 30-jähriger Erfahrung mit dieser Prüfung und trägt der Tatsache Rechnung, dass die Prüfung in andere Toxizitätsprüfungen eingebunden oder mit anderen Toxizitätsprüfungen kombiniert werden kann (z.B. mit Untersuchungen der Entwicklungs-, Reproduktions- und Genotoxizität); aufgrund ihrer Beschränkungen und der Verwendung einer großen Anzahl an Versuchstieren, soll diese Prüfmethode jedoch nicht als primäre Methode, sondern eher als ergänzende Prüfmethode angewendet werden, die nur dann zum Einsatz kommt, wenn aus rechtlichen Gründen keine Alternative besteht. Durch die Kombination von Toxizitätsprüfungen kann die Anzahl der für Toxizitätsprüfungen zu verwendenden Versuchstiere erheblich reduziert werden. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).

2. Mit der Dominant-Letal-Prüfung (DL-Prüfung) soll untersucht werden, ob Chemikalien aufgrund von Chromosomenaberrationen in Keimzellen Mutationen auslösen. Außerdem ist die Dominant-Letal-Prüfung für die Bewertung von Genotoxizität von Bedeutung, da trotz artenspezifischer Unterschiede Faktoren des Invivo-Stoffwechsels, der Pharmakokinetik und von DNA-Reparaturprozessen aktiv sind und zu den Reaktionen beitragen. Die Induktion einer DL-Mutation durch Behandlung mit einer Prüfchemikalie weist darauf hin, dass die Chemikalie das Keimgewebe des Versuchstiers geschädigt hat.

3. DL-Mutationen bewirken den Tod des Embryos bzw. des Fötus. Die Induktion einer DL-Mutation durch Behandlung mit einer Prüfchemikalie weist darauf hin, dass die Chemikalie die Keimzellen des Versuchstiers geschädigt hat.

4. Eine DL-Prüfung ist hilfreich für die Bestätigung positiver Prüfergebnisse mit somatischen Invivo-Endpunkten und stellt einen relevanten Endpunkt für die Abschätzung der Gefahren für den Menschen und des Risikos genetischer Erkrankungen dar, die über die Keimbahn übertragen werden. Dieser Versuch erfordert jedoch eine große Anzahl an Versuchstieren und ist arbeitsintensiv; daher ist die Durchführung dieses Versuchs sehr teuer und zeitaufwändig. Wegen der verhältnismäßig großen spontanen Häufigkeit von DL-Mutationen besteht bei diesem Versuch im Allgemeinen nur eine beschränkte Empfindlichkeit im Hinblick auf die Erkennung geringer Erhöhungen der Mutationshäufigkeit.

5. Die Definitionen der Schlüsselbegriffe sind Anlage 1 zu entnehmen.

Ausgangsüberlegungen

6. Meist wird die Prüfung an Mäusen durchgeführt (2) (3) (4). Andere Arten (beispielsweise Ratten) (5) (6) (7) (8) kommen manchmal möglicherweise ebenfalls in Betracht, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist. Dominante Letalgene sind im Allgemeinen auf starke Chromosomenaberrationen (strukturelle und numerische Anomalien) zurückzuführen (9) (10) (11), Genmutationen können jedoch nicht ausgeschlossen werden. DL-Mutationen sind Mutationen, die per se in einer Keimzelle oder nach der Befruchtung im frühen Embryonalstadium auftreten; sie verursachen keine Funktionsstörung der Gameten, sind aber für das befruchtete Ei oder den sich entwickelnden Embryo tödlich.

7. Einzelne männliche Tiere werden in angemessenen Abständen der Behandlung mit jungfräulichen weiblichen Tieren verpaart. Die Anzahl der Paarungen nach der Behandlung richtet sich nach dem eigentlichen Zweck der DL-Untersuchung (Nummer 23); sie muss ausreichen, um alle Stadien der Reifung männlicher Keimzellen einer Untersuchung auf dominante Letalgene unterziehen zu können (12).

8. Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfchemikalie oder ein reaktiver Metabolit bzw. reaktive Metaboliten die Hoden nicht erreicht bzw. erreichen, ist diese Prüfung nicht geeignet.

Prinzip der Prüfmethode

9. Im Allgemeinen werden die männlichen Tiere über einen geeigneten Expositionsweg mit einer Prüfchemikalie behandelt und dann mit unbehandelten jungfräulichen weiblichen Tieren verpaart. Verschiedene Keimzellarten können durch Verwendung aufeinander folgender Paarungsintervalle geprüft werden. Nach einer angemessenen Zeit nach der Paarung werden die weiblichen Tiere getötet und die Uteri der Tiere einer Untersuchung unterzogen, um die Anzahl der Implantate sowie der lebenden und der toten Embryonen zu ermitteln. Der dominante Letaleffekt einer Prüfchemikalie wird anhand des Vergleichs der lebenden Implantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe mit der Anzahl lebender Implantate pro weibliches Tier in der Vehikel-/Lösungsmittel-Kontrollgruppe bestimmt. Die Differenz zwischen der Anzahl toter Implantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe und der Anzahl toter Implantate pro weibliches Tier in der Kontrollgruppe entspricht dem durch die Prüfchemikalie induzierten Postimplantationsverlust. Der Postimplantationsverlust wird durch Ermittlung des Verhältnisses toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Verhältnis toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der Kontrollgruppe ermittelt. Der Präimplantationsverlust kann anhand des Vergleichs der Anzahl der Corpora lutea abzüglich der Gesamtzahl der Implantate bzw. der Anzahl der Gesamtimplantate pro weibliches Tier in der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe abgeschätzt werden.

Überprüfung der Eignung des Labors

10. Die Kompetenz zur Durchführung dieses Versuchs sollte durch den Nachweis der Fähigkeit zur Reproduktion der Häufigkeiten dominanter Letalgene aus veröffentlichten Daten (z.B. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) mit Positivkontrollstoffen (einschließlich schwacher Reaktionen) (wie beispielsweise in Tabelle 1 genannt) sowie mit Vehikeln und durch die Ermittlung von Häufigkeiten bei Negativkontrollen in einem annehmbaren Datenbereich (siehe vorstehende Literatur) oder - wenn verfügbar - durch die historische Kontrollverteilung des jeweiligen Labors belegt werden.

Beschreibung der Prüfmethode

Vorbereitungen

Auswahl von Versuchstierarten

11. Es sollten junge gesunde und geschlechtsreife Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Gewöhnlich werden Mäuse verwendet, doch kommen auch Ratten in Betracht. Außerdem können andere geeignete Säugetierarten verwendet werden, sofern dies im Bericht wissenschaftlich begründet wird.

Haltungs- und Fütterungsbedingungen

12. Bei Nagern sollte die Temperatur im Versuchstierraum 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte vorzugsweise bei 50 bis 60 % liegen, mindestens aber 40 % betragen und außer bei der Reinigung des Raumes 70 % nicht übersteigen. Der Raum sollte künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden sollte. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Auswahl des Futters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfchemikalie gewährleistet werden muss, wenn diese über das Futter verabreicht wird. Vor der Behandlung bzw. der Paarung sollten die Nager in kleinen gleichgeschlechtlichen Gruppen (höchstens fünf Tiere) gehalten werden, sofern kein aggressives Verhalten zu erwarten ist oder festgestellt wird, vorzugsweise in Käfigen mit festem Boden und angemessener Ausstattung des Lebensumfelds. Sie können auch einzeln gehalten werden, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist.

Vorbereitung der Versuchstiere

13. Gesunde und geschlechtsreife männliche und weibliche adulte Tiere werden randomisiert und den einzelnen Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen zugeteilt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere unter Verwendung einer humanen, minimalinvasiven Methode (z.B. durch Anbringen von Ringen, Marken oder Mikrochips oder durch biometrische Identifizierung, nicht jedoch durch Kupieren der Zehen oder Ohren). Die Tiere werden über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige standortbedingte Auswirkungen möglichst gering sind. Eine gegenseitige Kontamination durch die Positivkontrolle und die Prüfchemikalie ist zu vermeiden. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der Tiere vom Mittelwert so gering wie möglich sein und bei beiden Geschlechtern nicht mehr als ± 20 % betragen.

Vorbereitung der Dosierung

14. Feste Prüfchemikalien sollten vor der Verabreichung an die Tiere in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert oder in das Futter bzw. das Trinkwasser gegeben werden. Flüssige Prüfchemikalien können direkt verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Bei Exposition durch Inhalation können die Prüfchemikalien je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften als Gase, Dämpfe oder festes/flüssiges Aerosol verabreicht werden. Es sind frische Zubereitungen der Prüfchemikalie zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen, und die entsprechenden Lagerbedingungen werden definiert.

Prüfbedingungen

Lösungsmittel/Vehikel

15. Das Lösungsmittel/Vehikel sollte in der verwendeten Dosierung keine toxischen Wirkungen hervorrufen und nicht im Verdacht stehen, mit der Prüfchemikalie eine chemische Reaktion einzugehen. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel/Vehikel verwendet werden. Beispiele für üblicherweise verwendete, kompatible Lösungsmittel/Vehikel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Methylcelluloselösung, Carboxymethylcellulose-Natriumsalzlösung, Olivenöl und Maisöl.

Positivkontrollen

16. Grundsätzlich sind parallel Positivkontrolltiere zu verwenden, wenn das Labor nicht seine Befähigung zur Durchführung der Prüfung nachgewiesen und die Prüfung in letzter Zeit (beispielsweise in den letzten 5 Jahren) nicht regelmäßig durchgeführt hat. Allerdings brauchen Positivkontrolltiere nicht auf demselben Expositionsweg wie die mit der Prüfchemikalie behandelten Tiere behandelt und nicht für alle Paarungsintervalle Proben genommen zu werden. Die Positivkontrollstoffe sollten unter den in der Prüfung bestehenden Bedingungen bekanntermaßen dominante Letalgene induzieren. Bis auf die Verabreichung der Prüfchemikalie sind die Tiere der Kontrollgruppen ebenso zu behandeln wie die Tiere der Behandlungsgruppen.

17. Die Dosen der Positivkontrollstoffe sind so auszuwählen, dass sie schwache oder moderate Wirkungen hervorrufen, mit denen die Leistung und Empfindlichkeit des Versuchs kritisch bewertet werden können, gleichzeitig aber konsistent positive dominante Letaleffekte induziert werden. Beispiele für Positivkontrollstoffe und für geeignete Dosierungen sind Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1 Beispiele für Positivkontrollstoffe

Negativkontrollen

18. In jede Probenahme sind Negativkontrolltiere einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel oder ein Vehikel erhalten und ansonsten in derselben Weise behandelt werden wie die Behandlungsgruppen (20). Um die Eignung der Vehikelkontrolle festzustellen, sollten darüber hinaus in jede Probenahme auch unbehandelte Kontrolltiere einbezogen werden, soweit keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vorliegen, aus denen hervorgeht, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine dominanten Letalgene und keine sonstigen schädlichen Wirkungen induziert.

Verfahren

Anzahl der Versuchstiere

19. Einzelne männliche Tiere werden nacheinander in geeigneten zuvor festgelegten Intervallen (z.B. wöchentlich, Nummern 21 und 23) vorzugsweise mit einem jungfräulichen weiblichen Tier verpaart. Die Anzahl der männlichen Tiere pro Gruppe sollte so gewählt werden, dass sie (in Verbindung mit der Anzahl der verpaarten weiblichen Tiere in den einzelnen Paarungsintervallen) ausreichend ist, um die erforderliche statistische Aussagekraft für den Nachweis mindestens einer Verdopplung der Häufigkeit dominanter Letalgene (Nummer 44) sicherzustellen.

20. Die Anzahl der weiblichen Tiere pro Paarungsintervall sollte anhand von Berechnungen der statistischen Aussagekraft so gewählt werden, dass mindestens eine Verdopplung der Häufigkeit dominanter Letalgene nachgewiesen werden kann (d. h. ausreichend trächtige weibliche Tiere zur Hervorbringung von insgesamt mindestens 400 Implantaten) (20) (21) (22) (23) und dass mindestens ein totes Implantat pro Analyseeinheit (d. h. Paarungsgruppe pro Dosis) zu erwarten ist (24).

Verabreichungsdauer und Paarungsintervalle

21. Die Anzahl der Paarungsintervalle nach der Behandlung richtet sich nach dem Behandlungsplan; sie sollte gewährleisten, dass alle Stadien der Reifung männlicher Keimzellen auf die Induzierung dominanter Letalgene untersucht werden (12) (25). Bei einer Einzelbehandlung unter Verabreichung von bis zu fünf Tagesdosen sollten nach der letzten Behandlung in wöchentlichen Abständen 8 (Mäuse) bzw. 10 (Ratten) Paarungen vorgenommen werden. Bei Mehrfachdosierungen kann die Anzahl der Paarungsintervalle entsprechend dem Anteil der längeren Dauer des Verabreichungszeitraums reduziert werden, sofern alle Phasen der Spermatogenese wie vorgesehen evaluiert werden können (nach einer Expositionsdauer von 28 Tagen beispielsweise sind bei Mäusen bereits 4 wöchentliche Paarungen zur Evaluierung aller Phasen der Spermatogenese ausreichend). Alle Behandlungs- und Paarungspläne sollten wissenschaftlich begründet sein.

22. Weibliche Tiere sollten mindestens für die Dauer eines Östruszyklus (bei Mäusen und Ratten jeweils eine Woche) mit den männlichen Tieren zusammenbleiben. Weibliche Tiere, die sich innerhalb dieser Woche nicht gepaart haben, können für ein späteres Paarungsintervall verwendet werden. Alternativ können die Tiere zusammenbleiben, bis die Paarung erfolgt ist (was durch die Feststellung von Spermien in der Vagina oder das Vorliegen eines Vaginalpropfs nachzuweisen ist).

23. Die Exposition und der Paarungsplan hängen vom eigentlichen Zweck der DL-Untersuchung ab. Wenn das Ziel in der Feststellung besteht, ob eine bestimmte Chemikalie per se DL-Mutationen induziert, besteht die akzeptierte Methode in der Exposition eines vollständigen Spermatogenesezyklus (beispielsweise 7 Wochen bei Mäusen und 5-7 Behandlungen wöchentlich) und einer Paarung am Ende des Zyklus. Besteht das Ziel jedoch in der Ermittlung des Keimzellentyps, in dem dominante Letalgene induziert werden können, ist eine einmalige Exposition (über 5 Tage) mit einer anschließenden Paarungszeit von einer Woche vorzuziehen.

Dosierungen

24. Wenn zunächst eine Dosisfindungsstudie durchgeführt wird, da keine geeigneten Daten zur Dosierungswahl verfügbar sind, sollte diese im gleichen Labor unter Verwendung des/der gleichen Spezies, Rasse, Geschlechts und Behandlungsverfahrens wie im Hauptversuch stattfinden (26). Ziel der Studie sollte sein, die maximal verträgliche Dosis (MTD) zu ermitteln, die definiert ist als die höchste Dosierung, die vertragen wird, ohne dass Anzeichen von Toxizität auftreten, die die Studie, bezogen auf den Untersuchungszeitraum, begrenzen würden (z.B. durch Abweichungen in Verhalten oder Reaktionen, geringen Rückgang des Körpergewichts oder Zytotoxizität des blutbildenden Systems, ausgenommen jedoch Tod oder Anzeichen von Schmerzen und Leiden, die eine humane Tötung erforderlich machen würden (27)).

25. Die maximal verträgliche Dosis (MTD) darf zudem den Paarungserfolg nicht beeinträchtigen (21).

26. Prüfchemikalien mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei niedrigen, nicht toxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) und Chemikalien mit gesättigten toxikokinetischen Eigenschaften können als Ausnahmen von den Kriterien zur Dosisfestsetzung angesehen werden und sind auf Fallbasis zu bewerten.

27. Um Dosis-Wirkungs-Informationen zu erhalten, sollte eine vollständige Studie eine Negativkontrollgruppe und mindestens drei Dosierungen enthalten, die sich in der Regel um einen Faktor von 2 (maximal von 4) unterscheiden. Ruft die Prüfchemikalie in einer Dosisfindungsstudie oder nach bereits vorhandenen Daten keine Toxizität hervor, so sollte die Höchstdosis für eine Einzelgabe 2 000 mg/kg Körpergewicht betragen. Wirkt die Prüfchemikalie jedoch toxisch, sollte die MTD die höchste verabreichte Dosierung sein und die Dosierung vorzugsweise einen Bereich vom Höchstwert bis zu einer Dosierung abdecken, die wenig oder keine Toxizität erzeugt. Bei nicht toxischen Chemikalien beträgt die Grenzdosis für einen Verabreichungszeitraum von mindestens 14 Tagen 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag und bei Verabreichungszeiträumen von weniger als 14 Tagen 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag.

Verabreichung der Dosen

28. Bei der Versuchsplanung ist der zu erwartende Expositionsweg beim Menschen zu berücksichtigen. Daher können mit entsprechender Begründung Verabreichungswege wie etwa eine Aufnahme über die Nahrung, über das Trinkwasser, eine subkutane, intravenöse, topische oder orale (über eine Magensonde) Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation oder Implantation gewählt werden. In jedem Fall sollte der Verabreichungsweg so gewählt werden, dass das bzw. die Zielgewebe eine angemessene Exposition erfährt bzw. erfahren. Eine intraperitoneale Injektion wird in der Regel nicht empfohlen, da diese nicht als Verabreichungsweg beim Menschen vorgesehen ist, und sollte nur mit spezieller wissenschaftlicher Begründung angewandt werden. Sofern die Prüfchemikalie der Nahrung oder dem Trinkwasser beigemischt wird, ist insbesondere im Fall von Einzeldosierungen darauf zu achten, dass ein ausreichender Abstand zwischen der Nahrungsmittel- und Trinkwasseraufnahme und der Paarung eingehalten wird, damit ein Nachweis der Wirkungen möglich ist (Nummer 31). Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte im Normalfall 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten, bei wässrigen Lösungen kommen aber auch 2 ml/100 g in Betracht. Werden größere Volumina verwendet (sofern nach Tierschutzvorschriften erlaubt), ist dies zu begründen. Schwankungen der Prüfvolumina sind durch entsprechende Dosierung so gering wie möglich zu halten, damit bei allen Dosen ein gemessen am Körpergewicht gleich bleibendes Volumen gewährleistet ist.

Beobachtungen

29. Mindestens einmal täglich - vorzugsweise zum gleichen Zeitpunkt und unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten ist - sollten allgemeine klinische Beobachtungen der Versuchstiere vorgenommen und protokolliert werden. Mindestens zweimal täglich während der Verabreichungszeit sind alle Tiere auf Morbidität und Mortalität zu überprüfen. Alle Tiere sollten zu Studienbeginn und mindestens einmal pro Woche während Studien mit Wiederholungsdosen sowie bei humaner Tötung gewogen werden. Die Futteraufnahme wird mindestens wöchentlich gemessen. Wenn die Prüfchemikalie über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme bei jedem Wasserwechsel und mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Tiere mit Anzeichen von übermäßiger, jedoch nicht tödlich wirkender Toxizität sollten vor Ende des Prüfzeitraums human getötet werden (27).

Gewebeentnahme und -verarbeitung

30. Weibliche Tiere werden in der zweiten Hälfte der Gravidität am Trächtigkeitstag (GD) 13 bei Mäusen bzw. an GD 14-15 bei Ratten human getötet. Die Uteri werden auf dominante Letaleffekte untersucht, um die Anzahl der Implantate, der lebenden und toten Embryonen und der Corpora lutea zu ermitteln.

31. Die Uterushörner und die Ovarien werden freigelegt, um die Corpora lutea zählen zu können, und die Feten werden entfernt, gezählt und gewogen. Die Uteri sind sorgfältig auf durch lebende Feten verdeckte Resorptionen zu prüfen. Dabei sollte sichergestellt werden, dass alle Resorptionen gezählt werden. Die Fötusmortalität wird dokumentiert. Die Anzahl der erfolgreich befruchteten weiblichen Tiere und die Gesamtzahl der Implantate sowie die Präimplantationsverluste und die Postimplantationsmortalität (einschließlich Früh- und Spätresorptionen) sind ebenfalls zu erfassen. Außerdem können die sichtbaren Feten mindestens 2 Wochen in Bouinscher Lösung fixiert und anschließend auf schwere äußerliche Fehlbildungen untersucht werden (28), um weitere Informationen über die reproduktions- und entwicklungsbezogenen Auswirkungen der Prüfchemikalie zu erhalten.

Daten und Berichterstattung

Auswertung der Ergebnisse

32. Die Daten sind in tabellarischer Form unter Angabe der Anzahl der verpaarten männlichen Tiere, der Anzahl der trächtigen weiblichen Tiere und der Anzahl nicht trächtiger weiblicher Tiere darzustellen. Die Ergebnisse jeder Paarung einschließlich der Identität aller männlichen und weiblichen Tiere sind einzeln anzugeben. Für behandelte männliche Tiere sollten das Paarungsintervall und die Dosierung und für die einzelnen weiblichen Tiere die Anzahl lebender sowie toter Implantate dokumentiert werden.

33. Der Postimplantationsverlust wird durch Ermittlung des Verhältnisses toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der behandelten Gruppe im Vergleich zum Verhältnis toter Implantate zur Gesamtzahl der Implantate in der Vehikel-/Lösungsmittelkontrollgruppe ermittelt.

34. Der Präimplantationsverlust wird als Differenz zwischen der Anzahl der Corpora lutea und der Anzahl der Implantate oder als Verringerung der Durchschnittsanzahl der Implantate pro weibliches Tier gegenüber den Kontrollpaarungen berechnet. Wird der Präimplantationsverlust berechnet, ist er anzugeben.

35. Der DL-Faktor wird wie folgt berechnet: (Postimplantationsmortalität/Gesamtzahl der Implantate pro weibliches Tier) × 100.

36. Daten zur Toxizität und klinische Anzeichen (gemäß Nummer 29) sind zu dokumentieren.

Akzeptanzkriterien

37. Die folgenden Kriterien entscheiden über die Gültigkeit eines Versuchs:

• Die gleichzeitige Negativkontrolle wird im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Negativkontrolldaten und mit den historischen Kontrolldaten des Labors (sofern verfügbar) durchgeführt (Nummern 10 und 18).
• Gleichzeitige Positivkontrollen induzieren Reaktionen, die im Einklang mit veröffentlichten Normen für historische Positivkontrolldaten bzw. mit den historischen Kontrolldaten des Labors (sofern verfügbar) stehen und bewirken eine statistisch signifikante Erhöhung im Vergleich zur Negativkontrolle (Nummern 17 und 18).
• Eine angemessene Gesamtzahl an Implantaten und Dosierungen wurde analysiert (Nummer 20).
• Die Kriterien für die Auswahl der Höchstdosis entsprechen den Kriterien unter den Nummern 24 und 27.

Bewertung und Auswertung der Ergebnisse

38. Es sind mindestens drei behandelte Dosisgruppen zu analysieren, um ausreichende Daten für Dosis-Wirkungs-Analysen zu liefern.

39. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn

• mindestens eine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle aufweist,
• die Zunahme im Hinblick auf mindestens eine Versuchsbedingung (z.B. ein Paarungsintervall von einer Woche) bei Auswertung mit einer geeigneten Prüfung dosisabhängig ist und
• Ergebnisse außerhalb des akzeptablen Bereichs für Negativkontrolldaten bzw. der Verteilung der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z.B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere DL-Mutationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind Nummer 44 zu entnehmen; weitere statistische Ansätze werden in der Fachliteratur empfohlen (20) (21) (22) (24) (29). Bei durchgeführten statistischen Prüfungen sollte das Tier als Versuchseinheit zugrunde gelegt werden.

40. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn

• keine der Versuchsdosierungen eine statistisch signifikante Zunahme gegenüber der gleichzeitigen Negativkontrolle hervorruft,
• bei keiner Versuchsbedingung eine dosisabhängige Zunahme festzustellen ist und
• alle Ergebnisse innerhalb eines akzeptablen Bereichs der historischen Negativkontrolldaten des Labors (z.B. der auf einer Poisson-Verteilung beruhenden Kontrollgrenze von 95 %) liegen (sofern verfügbar).

Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie nicht geeignet ist, in Keimzellen der Versuchstiere DL-Mutationen zu induzieren.

41. Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.

42. In den Fällen, in denen die Reaktion weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern (z.B. eine geringe oder grenzwertige Zunahme), sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen der vorliegenden abgeschlossenen Versuche bewertet werden (beispielsweise wenn beurteilt werden soll, ob das positive Ergebnis außerhalb des akzeptablen Bereichs von Negativkontrolldaten oder der historischen Negativdaten des betreffenden Labors liegt) (30).

43. In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen, so dass die Reaktion als nicht eindeutig eingestuft wird.

44. Bei durchgeführten statistischen Prüfungen sollte das männliche Tier als Versuchseinheit zugrunde gelegt werden. Die Zähldaten (z.B. die Anzahl der Implantate pro weibliches Tier) können auf einer Poisson-Verteilung beruhen, und/oder Anteile (etwa der Anteil toter Implantate) können eine Binomialverteilung ergeben; diese Daten weisen häufig jedoch eine übermäßige Verteilung auf (31). Daher sollte bei der statistischen Analyse zunächst mithilfe von Varianztests wie z.B. des Cochran-Tests zur Ermittlung der binomialen Varianz (32) oder des Tarone-C(±)-Tests zur Ermittlung einer binomialen übermäßigen Verteilung (31) (33) eine Untersuchung auf übermäßige oder zu geringe Verteilung vorgenommen werden. Wenn keine Abweichungen von der Binomialverteilung festgestellt wird, kann mit dem Cochran-Armitage-Trendtest (34) und mit paarweisen Vergleichen mit der Kontrollgruppe mit dem exakten Test nach Fischer (35) eine Untersuchung auf die Entwicklung von Anteilen bei verschiedenen Dosierungen vorgenommen werden. Ähnlich können dann, wenn keine Abweichungen von der Poisson-Verteilung festgestellt werden, Entwicklungen der Zahlen durch Poisson-Regression untersucht (36) und paarweise Vergleiche mit der Kontrollgruppe vor dem Hintergrund des Poisson-Modells mithilfe von Kontrastpaaren vorgenommen werden (36). Wenn eine signifikant übermäßig starke oder geringe Verteilung festgestellt wird, werden parameterfreie Methoden empfohlen. (23) (31). Dazu zählen rangbezogene Prüfungen wie der Jonckheere-Terpstra-Trendtest (37) und Mann-Whitney-Tests (38) für paarweise Vergleiche mit der Vehikel-/Lösungsmittel-Kontrollgruppe sowie Permutations-, Resampling- oder Bootstrap-Trendtests und paarweise Vergleiche mit der Kontrollgruppe (31) (39).

45. Eine DL-Prüfung mit positivem Ergebnis ist ein Nachweis für die Genotoxizität der Prüfchemikalie an den Keimzellen der behandelten männlichen Tiere der Versuchstierart.

46. Indem ermittelt wird, ob die gemessenen Werte innerhalb oder außerhalb des historischen Kontrollbereichs liegen, lassen sich Leitlinien für die Bewertung der biologischen Signifikanz der Reaktion herleiten (40).

Prüfbericht

47. Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:

Zusammenfassung

Prüfchemikalie:

• Herkunft, Chargennummer, ggf. begrenztes Verwendungsdatum;
• Stabilität der Prüfchemikalie, falls bekannt;
• Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel, falls bekannt;
• Messung des pH-Werts, der Osmolalität und ggf. des Niederschlags im Kulturmedium, dem die Prüfchemikalie zugegeben wurde.

Einkomponentiger Stoff:

• physikalisches Erscheinungsbild, Wasserlöslichkeit und weitere relevante physikalisch-chemische Eigenschaften;
• chemische Bezeichnung, wie z.B. IUPAC- oder CAS-Bezeichnung, CAS-Nummer, SMILES- oder InChI-Code, Strukturformel, Reinheit, chemische Zusammensetzung von Verunreinigungen, soweit zutreffend und praktisch durchführbar, usw.

Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:

• so weit wie möglich charakterisiert durch die chemische Zusammensetzung (siehe oben), das quantitative Vorkommen und die relevanten physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten.

Zubereitung der Prüfchemikalie:

• Begründung der Auswahl des Vehikels;
• Löslichkeit und Stabilität der Prüfchemikalie im Lösungsmittel/Vehikel, falls bekannt;
• Zubereitung von Formulierungen für Nahrung, Trinkwasser oder Inhalationspräparaten;
• analytische Bestimmung der Formulierungen (z.B. Stabilität, Homogenität, nominale Konzentrationen), wenn erfolgt.

Versuchstiere:

• Art/Stamm und Begründung der getroffenen Wahl;
• Anzahl, Alter und Geschlecht der Tiere;
• Herkunft der Tiere, Haltungsbedingungen, Futter usw.;
• Methode zur eindeutigen Identifizierung der Tiere;
• bei Kurzzeitstudien: individuelles Körpergewicht der männlichen Tiere zu Beginn und am Ende der Studie; bei Studien über einer Woche: individuelles Körpergewicht während der Studie und Futteraufnahme. Bereich des Körpergewichts, Mittelwert und Standardabweichung für jede Gruppe.

Prüfbedingungen:

• Daten zu den Positiv- und Negativkontrollen (Vehikel/Lösungsmittel),
• Daten aus der Dosisfindungsstudie,
• Begründung der gewählten Dosisstufen;
• Angaben zur Zubereitung der Prüfchemikalie;
• Angaben zur Verabreichung der Prüfchemikalie;
• Begründung des Verabreichungswegs;
• Methoden zur Toxizitätsmessung beim Tier, einschließlich, soweit verfügbar, histopathologischer oder hämatologischer Analysen, sowie Angaben zur Häufigkeit, mit der die Tiere beobachtet und ihre Körpergewichte gemessen wurden;
• Methoden zur Überprüfung, ob die Prüfchemikalie ins Zielgewebe oder in den allgemeinen Kreislauf gelangt ist, im Falle negativer Ergebnisse;
• tatsächliche Dosis (mg/kg Körpergewicht/Tag), berechnet aus der Konzentration der Prüfchemikalie im Futter/Wasser (ppm) und der Futter- bzw. Wasseraufnahme, falls zutreffend;
• Angaben über Futter- und Wasserqualität;
• Angaben zur Ausgestaltung der Käfigumgebung;
• detaillierte Beschreibung der Behandlungs- und Probenahmepläne und Begründung der jeweils getroffenen Wahl;
• Analgesiemethode;
• Tötungsmethode;
• Verfahren zur Isolierung und Konservierung der Gewebe;
• Herkunft und Chargennummern aller Laborkits und Reagenzien (soweit zutreffend);
• Methoden zur Auszählung von dominanten Letalgenen;
• Paarungsplan;
• Verfahren zur Feststellung, ob die Paarung erfolgt ist;
• Tötungszeitpunkt;
• Kriterien für die Auswertung von DL-Effekten einschließlich Corpora lutea, Implantaten, Resorptionen und Präimplantationsverlusten, lebenden Implantaten und toten Implantaten.

Ergebnisse:

• Zustand des Tiers vor und während des Prüfzeitraums, einschließlich Anzeichen von Toxizität;
• Körpergewicht der männlichen Tiere während der Behandlung und während der Paarungszeit;
• Zahl der verpaarten weiblichen Tiere;
• gegebenenfalls Dosis-Wirkungsverhältnis;
• Daten über Negativkontrolltiere, die gleichzeitig in den Versuch einbezogen waren, und historische Kontrolldaten aus Negativkontrollen mit Angaben zu Bereichen, Mittelwerten und Standardabweichungen;
• Daten zu gleichzeitigen Positivkontrollen;
• tabellarische Daten zu den einzelnen Muttertieren, Anzahl der Corpora lutea pro Muttertier, Anzahl der Implantate pro Muttertier, Anzahl der Resorptionen und der Präimplantationsverluste pro Muttertier, Anzahl lebender Implantate pro Muttertier, Anzahl toter Implantate pro Muttertier, Gewicht der Feten;
• die vorstehenden Daten aggregiert für die einzelnen Paarungszeiten und Dosierungen mit Häufigkeiten dominanter Letalgene;
• statistische Analysen und angewandte Methoden.

Diskussion der Ergebnisse:

Schlussfolgerung.

Literatur

(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment No. 234, OECD, Paris.

(2) Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey u. a. (Hrsg.), S. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3) Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Müller, D., Pheh, J., Röhrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M. und Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Erstellt von der Arbeitsgruppe "Dominant" lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4) Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. Pharmacol., 352:159-167.

(5) Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. und Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6) Anderson,D., Hughes, J.A., Edwards, A.J., u Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7) Shively, C.A., White, D.M., Blauch, J.L. und Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. Pharmacol., 20:325-329.

(8) Rao, K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. und Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9) Brewen, J.G., Payne, H.S., Jones, K.P. und Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10) Marchetti, F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. und Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11) Marchetti, F. und Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12) Adler, I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13) Favor, J. und Crenshaw, J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14) Generoso, W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. und Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15) Hastings, S.E., Huffman, K.W. und Gallo, M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40: 371-378.

(16) James, D.A. und Smith, D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17) Shelby, M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. und Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173: 35-40.

(18) Sudman, P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. und Generoso, W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19) Holstrom, L.M., Palmer, A.K. und Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland, D.J. und Fox, M. (Hrsg.), Cambridge University Press, S. 129-156.

(20) Adler, I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. und Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19-30.

(21) Adler, I.D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. und Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312: 313-318.

(22) Generoso, W.M. und Piegorsch, W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23) Haseman, J.K. und Soares, E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24) Whorton, E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample SIZE Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 - 360.

(25) Anderson, D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S. und Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. und Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.

(28) Barrow, M.V., Taylor, W.J. und Morphol, J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291-306.

(29) Kirkland, D.J., (Hrsg.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. und Thybaud, V. (2011)."Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data", Mutation. Res., 723:87-90.

(31) Lockhart, A.C., Piegorsch, W.W. und Bishop, J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32) Cochran, W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common Ç2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33) Tarone, R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34) Margolin, B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz, S. und Johnson, N. L. (Hrsg.), S. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35) Cox, D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36) Neter, J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. und Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37) Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38) Conover, W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39) Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40) Fleiss, J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

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Abb. 1: Übersicht über die Dauer (in Tagen) der Entwicklung männlicher Keimzellen bei Mäusen und Ratten und beim Menschen. In den grau dargestellten Zeiträumen kommt es nicht zu DNA-Reparaturen.

In der vorstehenden Abbildung wird die Spermatogenese bei Mäusen und Ratten sowie beim Menschen schematisch dargestellt (entnommen aus Adler, 1996). Zu den nicht differenzierten Spermatogonien zählen: Spermatogonien der Typen A single, A paired und A ALIGNed (Hess und de Franca, 2008). Der Typ A single wird als echter Stammzellentyp betrachtet; um die Auswirkungen auf Stammzellen zu beurteilen, müssen daher mindestens 49 Tage (bei Mäusen) zwischen der letzten Injektion der Prüfchemikalie und der Paarung vergehen.

Literatur

Adler, I.D. (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, R.A., Moore, B.J. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Hrsg.), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.