umwelt-online: Verordnung (EG) Nr. 440/2008 zur Festlegung von Prüfmethoden gemäß der VO (EG) Nr. 1907/2006 zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) (12)
| zurück |
|
B.23 Spermatogonien-Prüfung auf Chromosomenaberrationen bei Säugetieren
Einleitung
1. Diese Prüfmethode (PM) entspricht der OECD-Prüfrichtlinie (TG) 483 (2016). Die Prüfmethoden werden regelmäßig überarbeitet, um dem wissenschaftlichen Fortschritt, sich ändernden Rechtsvorgaben und Belangen des Tierschutzes gerecht zu werden. Diese modifizierte Fassung der Prüfmethode beruht auf langjähriger Erfahrung mit diesem Versuch und trägt der Tatsache Rechnung, dass die Prüfung in andere Toxizitäts- oder Genotoxizitätsuntersuchungen eingebunden oder mit anderen Toxizitäts- oder Genotoxizitätsuntersuchungen kombiniert werden kann. Durch die Kombination von Toxizitätsuntersuchungen kann die Anzahl der Versuchstiere in Toxizitätsprüfungen verringert werden. Diese Prüfmethode ist Bestandteil einer Reihe von Prüfmethoden zur genetischen Toxikologie. Die OECD hat ein Dokument erstellt, das kurz gefasste und hilfreiche Informationen zu Untersuchungen zur genetischen Toxikologie sowie eine Übersicht über die jüngsten Änderungen der OECD-Prüfrichtlinien zur genetischen Toxikologie enthält (1).
2. Die Invivo-Spermatogenienprüfung auf Chromosomenaberrationen bei Säugetieren dient zum Nachweis von Chemikalien, die bei Säugetieren strukturelle Chromosomenaberrationen in den Spermatogonien auslösen (2) (3) (4). Außerdem ist diese Prüfung insbesondere für die Bewertung der Genotoxizität relevant, da trotz artenspezifischer Unterschiede Faktoren des Invivo-Stoffwechsels, der Pharmakokinetik und von DNA-Reparaturprozessen aktiv sind und zu den Reaktionen beitragen. Allerdings ist diese Methode nicht zur Messung numerischer Anomalien bestimmt und wird folglich auch nicht routinemäßig dafür eingesetzt.
3. Mit dieser Prüfung werden strukturelle Chromosomenaberrationen (sowohl Chromosomentyp- als auch Chromatidtypaberrationen) bei der Teilung von Spermatogonien festgestellt, so dass Prognosen zur Auslösung vererbbarer Mutationen in Keimzellen getroffen werden können.
4. Definitionen der Schlüsselbegriffe sind der Anlage zu entnehmen.
Ausgangsüberlegungen
5. Bei dieser Prüfung werden routinemäßig Nager eingesetzt, aber auch andere Arten können in einigen Fällen geeignet sein, sofern dies wissenschaftlich gerechtfertigt wird. Normalerweise entwickeln sich während der Zytogenese von Nagetierhoden mitotische (Spermatogonien) und meiotische (Spermatozyten) Metaphasen. Mitotische und meiotische Metaphasen werden nach der Chromosomenmorphologie bestimmt (4). Mit dieser zytogenetischen Invivo-Prüfung werden strukturelle Chromosomenaberrationen in Mitosen von Spermatogonien ermittelt. Andere Zielzellen sind nicht Gegenstand dieser Prüfmethode.
6. Zum Nachweis von Chromatidentypaberrationen in Spermatogonien ist die erste mitotische Zellteilung nach der Behandlung zu untersuchen, bevor diese Aberrationen sich bei anschließenden Zellteilungen zu Chromosomentypaberrationen entwickeln. Die meiotische Chromosomenanalyse der Spermatozyten in der Diakinese-Metaphase I und der Metaphase II auf Aberrationen der Chromosomenstruktur kann weitere nützliche Informationen liefern.
7. In den Hoden finden sich mehrere Generationen von Spermatogonien (5); diese verschiedenen Keimzellenarten reagieren unterschiedlich empfindlich auf die Behandlung mit Chemikalien. Die festgestellten Aberrationen stellen also eine Gesamtreaktion der behandelten Spermatogoniepopulationen dar. Die meisten mitotischen Zellen in Hodenpräperaten sind B-Spermatogonien mit einem Zellzyklus von 26 h (3).
8. Wenn Anzeichen dafür bestehen, dass die Prüfchemikalie oder ein reaktiver Metabolit bzw. reaktive Metaboliten die Hoden nicht erreicht bzw. erreichen, ist diese Prüfung nicht geeignet.
Prinzip der Prüfmethode
9. Im Allgemeinen werden die Tiere über einen geeigneten Expositionsweg mit einer Prüfchemikalie behandelt und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Behandlung getötet. Vor der Tötung werden die Tiere mit einem Spindelgift (z.B. Colchicin oder Colcemid®) behandelt. Aus den Keimzellen werden dann Chromosomen präpariert und gefärbt, und die Metaphasezellen werden auf Chromosomenaberrationen untersucht.
Überprüfung der Eignung des Labors
10. Die Kompetenz zur Durchführung dieses Versuchs sollte durch den Nachweis der Fähigkeit zur Reproduktion der erwarteten Ergebnisse in Bezug auf die Häufigkeit struktureller Chromosomenaberrationen bei Spermatogonien mit Positivkontrollstoffen (einschließlich schwacher Reaktionen) wie in Tabelle 1 genannt und durch Ermittlung von Häufigkeiten bei Negativkontrollen in einem annehmbaren Kontrolldatenbereich (siehe vorstehende Literatur, z.B. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) oder - wenn verfügbar - durch die historische Kontrollverteilung des jeweiligen Labors belegt werden.
Beschreibung der Prüfmethode
Vorbereitungen
Auswahl von Versuchstierarten
11. Es sollten junge gesunde und geschlechtsreife Tiere üblicher Labortierstämme zum Einsatz kommen. Im Allgemeinen werden männliche Mäuse verwendet; allerdings können auch männliche Tiere sonstiger geeigneter Säugetierarten zum Einsatz kommen, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist und diese Prüfung dann in Verbindung mit einer anderen Prüfmethode durchgeführt werden kann. Die wissenschaftliche Begründung für die Verwendung anderer Versuchstiere als Nager sollte in den Bericht aufgenommen werden.
Haltungs- und Fütterungsbedingungen
12. Bei Nagern sollte die Temperatur im Versuchstierraum 22 °C (± 3 °C) betragen. Die relative Luftfeuchtigkeit sollte vorzugsweise bei 50 bis 60 % liegen, mindestens aber 40 % betragen und außer bei Reinigung des Raumes 70 % nicht übersteigen. Der Raum sollte künstlich beleuchtet sein, wobei die Beleuchtung im 12-Stunden-Rhythmus ein- und ausgeschaltet werden sollte. An die Versuchstiere kann herkömmliches Laborfutter verfüttert werden, wobei eine unbegrenzte Trinkwasserversorgung zu gewährleisten ist. Die Auswahl des Futters wird eventuell dadurch beeinflusst, dass eine geeignete Beimischung einer Prüfchemikalie gewährleistet werden muss, wenn diese über das Futter verabreicht wird. Nager sollten in kleinen Gruppen (maximal fünf pro Käfig) untergebracht werden, sofern kein aggressives Verhalten zu erwarten ist, vorzugsweise in Käfigen mit festem Boden und angemessener Ausgestaltung des Lebensumfelds. Sie können auch einzeln gehalten werden, wenn dies wissenschaftlich gerechtfertigt ist.
Vorbereitung der Versuchstiere
13. Gewöhnlich werden gesunde, adulte männliche Tiere (zu Beginn der Behandlung 8-12 Wochen alt) nach dem Zufallsprinzip in die Kontroll- bzw. Behandlungsgruppen eingeteilt. Es erfolgt eine Einzelidentifizierung der Tiere unter Verwendung einer humanen, minimalinvasiven Methode (z.B. durch Anbringen von Ringen, Marken oder Mikrochips oder durch biometrische Identifizierung, nicht jedoch durch Kupieren der Ohren oder Zehen). Die Tiere werden über einen Zeitraum von mindestens fünf Tagen unter Laborbedingungen eingewöhnt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige standortbedingte Auswirkungen möglichst gering sind. Eine gegenseitige Kontamination durch die Positivkontrolle und die Prüfchemikalie ist zu vermeiden. Zu Beginn des Versuchs sollte die Abweichung des Körpergewichts der einzelnen Tiere möglichst gering sein und nicht mehr als ± 20 % betragen.
Vorbereitung der Dosierung
14. Feste Prüfchemikalien sollten vor der Verabreichung an die Tiere in geeigneten Lösungsmitteln oder Vehikeln gelöst oder suspendiert oder in das Futter bzw. das Trinkwasser gegeben werden. Flüssige Prüfchemikalien können direkt verabreicht oder zuvor verdünnt werden. Bei Exposition durch Inhalation können die Prüfchemikalien je nach ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften als Gase, Dämpfe oder festes/flüssiges Aerosol verabreicht werden. Es sind frische Zubereitungen der Prüfchemikalie zu verwenden, es sei denn, die Stabilität der Chemikalie bei Lagerung wird nachgewiesen, und die entsprechenden Lagerbedingungen werden definiert.
Prüfbedingungen - Lösungsmittel/Vehikel
15. Das Lösungsmittel/Vehikel sollte bei den gewählten Dosierungen keine toxischen Wirkungen hervorrufen und mit den Prüfchemikalien keine chemische Reaktion eingehen. Werden keine allgemein bekannten Lösungsmittel/Vehikel verwendet, so sind Referenzdaten zur Kompatibilität beizubringen. Nach Möglichkeit sollte ein wässriges Lösungsmittel/Vehikel verwendet werden. Beispiele für üblicherweise verwendete, kompatible Lösungsmittel/Vehikel sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Methylcelluloselösung, Carboxymethylcellulose-Natriumsalzlösung, Olivenöl und Maisöl. Liegen keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vor, aus denen hervorgeht, dass keine strukturellen Chromosomenaberrationen und keine anderen schädlichen Wirkungen von einem gewählten, nicht gängigen Lösungsmittel/Vehikel ausgehen, sollte die Eignung des Lösungsmittels/Vehikels in einem Vorversuch nachgewiesen werden.
Positivkontrollen
16. Grundsätzlich sind parallel Positivkontrolltiere zu verwenden, wenn das Labor nicht seine Befähigung zur Durchführung der Prüfung nachgewiesen und die Prüfung in letzter Zeit (beispielsweise in den letzten 5 Jahren) nicht regelmäßig durchgeführt hat. Umfasst der Versuch keine gleichzeitige Positivkontrolle, sollten Auswertungskontrollen (fixierte und nicht angefärbte Objektträger) einbezogen werden. Dazu eignen sich Referenzproben, die im Rahmen eines gesonderten Positivkontrollversuchs in dem Labor entnommen und gelagert wurden, das den Versuch in regelmäßigen Zeitabständen (z.B. alle 6 bis 18 Monate) durchführt (z.B. bei Eignungsprüfungen und danach ggf. auf regelmäßiger Basis).
17. Positivkontrollstoffe sollten zuverlässig bewirken, dass die Häufigkeiten der Zellen mit Chromosomenaberrationen gemessen an den spontan entstehenden Zellmengen nachweislich zunehmen. Positivkontrolldosen sollten so gewählt werden, dass die Wirkungen eindeutig sind, die Labortechniker die kodierten Proben aber nicht identifizieren können. Beispiele für Positivkontrollstoffe sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Tabelle 1 Beispiele für Positivkontrollstoffe
| Stoffe [CAS-Nr.] (Referenznummer) |
| Cyclophosphamid(monohydrat) [CAS-Nr. 50-18-0 (CAS-Nr. 6055-19-2)] (9) |
| Cyclohexylamin [CAS-Nr. 108-91-8] (7) |
| Mitomycin C [CAS-Nr. 50-07-7] (6) |
| Monomeres Acrylamid [CAS 79-06-1] (10) |
| Triethylenmelamin [CAS-Nr. 51-18-3] (8) |
Negativkontrollen
18. In jede Probenahme sind Negativkontrolltiere einzubeziehen, die nur ein Lösungsmittel oder ein Vehikel erhalten und ansonsten in derselben Weise behandelt wurden wie die Behandlungsgruppen. Um die Eignung der Vehikelkontrolle festzustellen, sollten darüber hinaus in jede Probenahme auch unbehandelte Kontrolltiere einbezogen werden, soweit keine historischen oder veröffentlichten Kontrolldaten vorliegen, aus denen hervorgeht, dass das gewählte Lösungsmittel/Vehikel keine Chromosomenaberrationen und keine sonstigen schädlichen Wirkungen induziert.
Anzahl der Versuchstiere
19. Zu Beginn der Studie sollten die Gruppengrößen so bestimmt werden, dass pro Gruppe mindestens 5 männliche Tiere einbezogen werden. Diese Anzahl der Tiere pro Gruppe gilt als ausreichend für eine angemessene statistische Aussagekraft (d. h. für den Nachweis mindestens einer Verdopplung der Häufigkeit einer Chromosomenaberration bei einer Konzentration der Negativkontrolle von mindestens 1,0 % bei einer Wahrscheinlichkeit von 80 % und einer Signifikanz von 0,05) (3) (11). Als typische Höchstmenge an Versuchstieren bei einer Untersuchung mit zwei Probenahmezeitpunkten, drei Dosisgruppen und einer gleichzeitigen Negativkontrollgruppe zuzüglich einer Positivkontrollgruppe (wobei jede Gruppe aus fünf Tieren besteht) kann von maximal 45 Versuchstieren ausgegangen werden.
Behandlungsplan
20. Die Prüfchemikalien werden gewöhnlich einmal verabreicht (d. h. als Einzelbehandlung); wenn wissenschaftlich gerechtfertigt, können auch andere Dosierungspläne verwendet werden.
21. In der Gruppe mit der höchsten Dosis wird zu zwei verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung eine Stichprobe entnommen. Da die für die Aufnahme und Metabolisierung der Prüfchemikalie(n) sowie für die Wirkung auf die Zellzykluskinetik benötigte Zeit den optimalen Zeitpunkt für die Feststellung von Chromosomenaberrationen beeinflussen kann, erfolgen eine frühe Probenahme und eine weitere Probenahme etwa 24 bzw. 48 Stunden nach der Behandlung. Wenn nicht die Höchstdosis verabreicht wird, sollte die erste Probe 24 Stunden nach der Behandlung (d. h. spätestens bei Ablauf des Zellzyklus der B-Spermatogonien zur Maximierung der Wahrscheinlichkeit der Bewertung der ersten Metaphasen nach der Behandlung) entnommen werden, wenn nicht ein anderer Zeitpunkt für die Probenahme als besser geeignet bekannt und gerechtfertigt ist.
22. Für die Probenahme kommen auch andere Zeitpunkte in Frage. Bei Chemikalien, die beispielsweise S-unabhängige Effekte auslösen, ist möglicherweise eine Probenahme zu früheren Zeitpunkten (d. h. nach weniger als 24 h) angebracht.
23. Ein Behandlungsverfahren mit Wiederholungsdosis kann zur Anwendung kommen, beispielsweise in Verbindung mit einer Prüfung mit einem anderen Endpunkt und einem Verabreichungszeitraum von 28 Tagen (z.B. PM B.58); in diesem Fall werden jedoch weitere Tiergruppen benötigt, damit Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten genommen werden können. Die Eignung eines solchen Verfahrens muss jedoch in jedem Einzelfall wissenschaftlich gerechtfertigt sein.
24. Vor der Tötung wird den Tieren intraperitoneal eine geeignete Dosis eines Spindelgifts (z.B. Colcemid® oder Colchicin) verabreicht. Die Tiere werden dann zu einem geeigneten Zeitpunkt aufgearbeitet. Bei Mäusen und Ratten beträgt die betreffende Zeitspanne 3-5 Stunden.
Dosierungen
25. Wenn zunächst eine Dosisfindungsstudie durchgeführt wird, da noch keine geeigneten Daten aus anderen einschlägigen Studien zur Dosierungswahl vorliegen, sollte diese im selben Labor unter Verwendung von Tieren derselben Art und Rasse sowie nach demselben Behandlungsverfahren stattfinden, die nach den Empfehlungen für die Durchführung von Dosisfindungsstudien in der Hauptstudie durchzuführen sind (12). Ziel der Studie sollte sein, die maximal verträgliche Dosis (MTD) zu ermitteln, die als die Dosis definiert ist, die für die Dauer der Studie leichte toxische Wirkungen (z.B. Abweichungen in Verhalten oder Reaktionen, einen geringen Rückgang des Körpergewichts oder Zytotoxizität des blutbildenden Systems) induziert, jedoch weder zum Tod führt noch Anzeichen von Schmerzen, Leiden oder Ängsten hervorruft, die eine Tötung erforderlich machen würden (13).
26. Die Höchstdosis kann auch als jene Dosis definiert werden, die bestimmte Anzeichen von Toxizität in den Spermatogonien hervorruft (z.B. eine Reduzierung des Verhältnisses der Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase). Diese Reduzierung sollte nicht mehr als 50 % betragen.
27. Prüfchemikalien mit spezifischen biologischen Aktivitäten bei niedrigen, nicht toxischen Dosen (wie Hormone und Mitogene) und Chemikalien mit gesättigten toxikokinetischen Eigenschaften können als Ausnahmen von den Kriterien zur Dosisfestsetzung angesehen werden und sind auf Fallbasis zu bewerten.
28. Um Dosis-Wirkungs-Informationen zu erhalten, sollte eine vollständige Studie eine Negativkontrollgruppe (Nummer 18) und mindestens drei Dosierungen enthalten, die sich in der Regel um einen Faktor von 2 (maximal von 4) unterscheiden. Ruft die Prüfchemikalie in einer Dosisfindungsstudie oder nach bereits vorhandenen Daten keine Toxizität hervor, so sollte die Höchstdosis für eine Einzelgabe 2 000 mg/kg Körpergewicht betragen. Ruft die Prüfchemikalie jedoch Toxizität hervor, sollte die MTD die höchste verabreichte Dosierung sein und die Dosierung vorzugsweise einen Bereich vom Höchstwert bis zu einer Dosierung abdecken, die wenig oder keine Toxizität erzeugt. Wenn bei allen untersuchten Dosierungen toxische Wirkungen im Zielgewebe (d. h. in den Hoden) beobachtet werden, sind weitere Untersuchungen bei nichttoxischen Dosierungen anzuraten. Studien zur ausführlicheren Charakterisierung der quantitativen Dosis-Wirkungs-Informationen erfordern gegebenenfalls weitere Dosisgruppen. Bei bestimmten Arten von Prüfchemikalien (z.B. Humanpharmazeutika), für die spezielle Anforderungen gelten, können die Grenzen variieren. Wenn die Prüfchemikalie keine toxische Wirkung induziert, sollten die Grenzdosis sowie zwei geringere Dosen (wie oben beschrieben) ausgewählt werden. Die Grenzdosis für einen Verabreichungszeitraum von mindestens 14 Tagen beträgt 1 000 mg/kg Körpergewicht/Tag und bei Verabreichungszeiträumen von weniger als 14 Tagen 2 000 mg/kg Körpergewicht/Tag.
Verabreichung der Dosen
29. Bei der Versuchsplanung ist der zu erwartende Expositionsweg beim Menschen zu berücksichtigen. Daher können mit entsprechender Begründung Verabreichungswege wie etwa eine Aufnahme über die Nahrung, über das Trinkwasser, eine topische, subkutane, intravenöse oder orale (über eine Magensonde) Verabreichung oder eine Verabreichung durch Inhalation oder Implantation gewählt werden. In jedem Fall sollte der Verabreichungsweg so gewählt werden, dass eine angemessene Exposition des Zielgewebes sichergestellt ist. Eine Intraperitonealinjektion wird in der Regel nur in wissenschaftlich gerechtfertigten Fällen empfohlen, weil sie beim Menschen gewöhnlich keinen physiologisch relevanten Expositionsweg darstellt. Sofern die Prüfchemikalie der Nahrung oder dem Trinkwasser beigemischt wird, insbesondere im Fall von Einzeldosierungen, ist darauf zu achten, einen ausreichenden Abstand zwischen der Nahrungsmittel- und Trinkwasseraufnahme und der Probenahme einzuhalten, damit ein Nachweis der Wirkungen möglich ist (Nummer 33). Welches Flüssigkeitsvolumen jeweils höchstens durch Sonde oder Injektion verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte im Normalfall 1 ml/100 g Körpergewicht nicht überschreiten, bei wässrigen Lösungen kommen aber auch 2 ml/100 g Körpergewicht in Betracht. Werden größere Volumina verwendet (sofern nach Tierschutzvorschriften erlaubt), ist dies zu begründen. Schwankungen der Prüfvolumina sind durch entsprechende Dosierung so gering wie möglich zu halten, damit bei allen Dosen ein gemessen am Körpergewicht gleich bleibendes Volumen gewährleistet ist.
Anmerkungen
30. Mindestens einmal täglich - vorzugsweise zum gleichen Zeitpunkt und unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten ist - sollten allgemeine klinische Beobachtungen der Versuchstiere vorgenommen und protokolliert werden. Mindestens zweimal täglich sind alle Tiere auf Morbidität und Mortalität zu überprüfen. Alle Tiere sollten zu Studienbeginn und mindestens einmal pro Woche bei Studien mit wiederholter Verabreichung sowie bei der Tötung gewogen werden. In Studien von mindestens einwöchiger Dauer sollten mindestens wöchentlich Messungen der Futteraufnahme vorgenommen werden. Wenn die Prüfchemikalie über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme bei jedem Wasserwechsel und mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Tiere mit Anzeichen von übermäßiger, jedoch nicht tödlich wirkender Toxizität sollten vor Ende des Prüfzeitraums getötet werden (13).
Chromosomenpräparation
31. Unmittelbar nach der Tötung werden aus einem oder beiden Hoden Keimzellsuspensionen gewonnen, mit hypotoner Lösung behandelt und nach festgelegten Protokollen (z.B. (2) (14) (15)) fixiert. Die Zellen werden dann auf Objektträger aufgetropft und gefärbt (16) (17). Alle Objektträger sollten kodiert werden, damit sie bei der Auswertung nicht identifiziert werden können.
Analyse
32. Bei jedem Tier sollten mindestens 200 gut gespreizte Metaphasen analysiert werden (3)(11). Wenn die historische Häufigkeit bei Negativkontrollen < 1 % ist, sollten mehr als 200 Zellen pro Tier ausgewertet werden, um die statistische Aussagekraft zu erhöhen (3). Die angewendeten Färbemethoden sollten eine Identifizierung der Zentromere ermöglichen.
33. Chromosomentyp- und Chromatidentypaberrationen sollten gesondert erfasst und Subtypen zugeordnet werden (Brüche, Austausche). Bei der Prüfung, ob eine Chemikalie signifikante Erhöhungen der Inzidenz von Zellen mit Chromosomenaberrationen induziert, sollten Gaps erfasst, aber nicht berücksichtigt werden. Die Laborpraxis sollte gewährleisten, dass die Chromosomenaberrationen von gut ausgebildeten Labortechnikern analysiert werden. Da es bei der Präparation der Objektträger häufig zum Bruch eines Teils der Metaphasezellen und zum Verlust von Chromosomen kommt, sollten die ausgewerteten Zellen eine Zentromerzahl enthalten, die der Zahl 2n ± 2 entspricht, wobei n die haploide Chromosomenzahl für diese Spezies ist.
34. Obwohl es bei der Prüfung um den Nachweis struktureller Chromosomenaberrationen geht, sind die Häufigkeiten von polyploiden Zellen und von Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen bei Feststellung zu vermerken (Nummer 44).
Daten und Berichterstattung
Behandlung der Ergebnisse
35. Die Daten für die einzelnen Tiere sind in tabellarischer Form darzustellen. Für jedes Tier sind die Anzahl der Zellen mit strukturellen Chromosomenaberrationen und die Anzahl der Chromosomenaberrationen je Zelle anzugeben. Chromatidentyp- und Chromosomentypaberrationen, die Subtypen zugeordnet sind (Brüche, Austausche), sollten dabei unter Angabe ihrer Anzahl und Häufigkeit für Versuchs- und Kontrollgruppen getrennt erfasst werden. Gaps werden gesondert vermerkt. Die Häufigkeit der Gaps ist anzugeben, wird in der Regel bei der Analyse der Gesamthäufigkeit der Chromosomenaberrationen jedoch nicht berücksichtigt. Der Anteil der Zellen mit Polyploidie und der Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen wird angegeben, sofern beobachtet.
36. Daten zur Toxizität und klinische Anzeichen (gemäß Nummer 30) sind zu dokumentieren.
Akzeptanzkriterien
37. Die folgenden Kriterien entscheiden über die Gültigkeit eines Versuchs:
38. Werden sowohl Mitosen als auch Meiosen beobachtet, ist das Verhältnis der Spermatogonienmitosen zur ersten und zweiten meiotischen Metaphase als Gradmesser der Zytotoxizität bei allen behandelten Tieren und bei Tieren der Negativkontrolle in einer Gesamtstichprobe von 100 sich teilenden Zellen zu bestimmen, um eine mögliche zytotoxische Wirkung festzustellen. Werden nur Mitosen beobachtet, so ist der Mitoseindex für mindestens 1 000 Zellen je Tier zu bestimmen.
Beurteilung und Auswertung
39. Es sind mindestens drei behandelte Dosisgruppen zu analysieren, um ausreichende Daten für Dosis-Wirkungs-Analysen zu liefern.
40. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig positiv, wenn
Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere Chromosomenaberrationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind der Literatur zu entnehmen (11) (18). Die verwendeten statistischen Prüfungen müssen das Tier als Versuchseinheit berücksichtigen.
41. Unter der Voraussetzung, dass alle Akzeptanzkriterien erfüllt sind, gilt eine Prüfchemikalie als eindeutig negativ, wenn
Wenn diese Voraussetzungen erfüllt sind, wird angenommen, dass die Prüfchemikalie in Keimzellen der Versuchstiere keine Chromosomenaberrationen induziert. Empfehlungen zu den am besten geeigneten statistischen Methoden sind der Literatur zu entnehmen (11) (18). Ein negatives Ergebnis schließt nicht aus, dass die Chemikalie Chromosomenaberrationen in späteren Entwicklungsphasen induzieren könnte, die noch nicht untersucht wurden, oder dass sie Genmutationen auslöst.
42. Bei einer eindeutig positiven oder negativen Reaktion ist eine Verifizierung nicht erforderlich.
43. In den Fällen, in denen die Reaktion weder eindeutig negativ noch eindeutig positiv ist, oder um die biologische Relevanz eines Ergebnisses zu untermauern (z.B. eine geringe oder grenzwertige Zunahme), sollten die Daten durch eine fachkundige Beurteilung und/oder anhand weiterer Untersuchungen der vorliegenden abgeschlossenen Versuche bewertet werden (beispielsweise wenn beurteilt werden soll, ob das positive Ergebnis außerhalb des akzeptablen Bereichs von Negativkontrolldaten oder der historischen Negativdaten des betreffenden Labors liegt) (19).
44. In seltenen Fällen erlaubt der Datensatz selbst nach weiteren Untersuchungen keine definitive Aussage zu positiven oder negativen Ergebnissen, so dass die Reaktion als nicht eindeutig eingestuft wird.
45. Eine zahlenmäßige Zunahme der polyploiden Zellen deutet möglicherweise darauf hin, dass die Prüfchemikalie mitotische Prozesse zu hemmen und numerische Chromosomenaberrationen hervorzurufen vermag (20). Eine zahlenmäßige Zunahme der Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen ist möglicherweise ein Anzeichen dafür, dass die Prüfchemikalie die Zellzyklusprogression zu hemmen vermag (21) (22), die neben der Hemmung mitotischer Prozesse ebenfalls ein Mechanismus der Induzierung numerischer Chromosomenänderungen ist (Nummer 2). Die Inzidenz von polyploiden Zellen und Zellen mit endoreduplizierten Chromosomen sollte daher getrennt erfasst werden.
Prüfbericht
46. Der Prüfbericht sollte folgende Angaben enthalten:
Zusammenfassung
Prüfchemikalie:
Einkomponentiger Stoff:
Mehrkomponentiger Stoff, UVCB-Stoffe und Gemische:
Zubereitung der Prüfchemikalie:
Versuchstiere:
Prüfbedingungen:
Ergebnisse:
Erörterung der Ergebnisse
Schlussfolgerung
(1) OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris
(2) Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Hrsg. S. Venitt und J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, S. 275-306.
(3) Adler, I.-D., Shelby, M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. und Tanaka N. (1994). Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.
(4) Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.
(5) Hess, R.A. und de Franca, L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng, C.Y. (Hrsg.) Landes Bioscience und Springer Science+Business Media, S. 1-15.
(6) Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B. und Magnusson, J. (Hrsg.) Liss, New York, S. 477-484.
(7) Cattanach, B.M. und Pollard, C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.
(8) Cattanach, B.M. und Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.
(9) Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.
(10) Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.
(11) Adler, I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. und Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19-30.
(12) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. und Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
(13) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung, Paris.
(14) Yamamoto, K. und Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.
(15) Hsu, T.C., Elder, F. und Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.
(16) Evans, E.P., Breckon, G. und Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
(17) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Hrsg.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, S. 115-141.
(18) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. und Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Hrsg.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, S. 184-232.
(19) Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. und Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.
(20) Warr, T.J., Parry, E.M. und Parry, J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.
(21) Huang, Y., Change, C. und Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
(22) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.
| Begriffsbestimmungen | Anlage |
| Aneuploidie: | Abweichung von der normalen diploiden (oder haploiden) Chromosomenzahl durch ein einziges Chromosom oder mehr, nicht aber durch einen ganzen (oder mehrere) Chromosomensatz/-sätze (Polyploidie). |
| Chemikalie: | Ein Stoff oder ein Gemisch. |
| Chromatidentypaberration: | Strukturelle Chromosomenanomalie, gekennzeichnet durch Bruch einzelner Chromatiden oder Bruch und Reunion von Chromatiden. |
| Chromosomentypaberration: | Strukturelle Chromosomenanomalie, gekennzeichnet durch Bruch oder Bruch und Reunion beider Chromatiden an gleicher Position. |
| Chromosomenvielfalt: | Vielfalt der Formen (metazentrisch, akrozentrisch usw.) und Größen von Chromosomen. |
| Clastogen: | Jede Chemikalie, die strukturelle Chromosomenaberrationen in Zell- oder Organismenpopulationen verursacht. |
| Genotoxisch: | Allgemeiner Begriff, der alle Typen von DNA- oder Chromosomenschädigungen umfasst, einschließlich Brüchen, Deletionen, Addukten, Nukleotidmodifikationen und -verknüpfungen, Rearrangements, Mutationen, Chromosomenaberrationen sowie Aneuploidie. Nicht alle genotoxischen Effekte führen zu Mutationen oder stabilen Chromosomenschäden. |
| Gap: | Achromatische Läsion von geringerer Breite als eine Chromatide und mit minimaler Verlagerung der Chromatiden. |
| Mitose: | Teilung des Zellkerns, die in der Regel in Prophase, Prometaphase, Metaphase, Anaphase und Telophase gegliedert ist. |
| Mitoseindex (MI): | Anteil der Zellen einer Zellpopulation, die sich zum Beobachtungszeitpunkt in der Metaphase befinden: Gradmesser für den Vermehrungsgrad dieser Population. |
| Mutagen: | Auslöser einer Erbgutveränderung der DNA-Basenpaarsequenz(en) in Genen oder in der Chromosomenstruktur (Chromosomenaberrationen). |
| Numerische Anomalie: | Abweichung der Chromosomenzahl vom Normalwert, der für die verwendeten Tiere charakteristisch ist. |
| Polyploidie: | Vorhandensein von mehr als zwei haploiden Chromosomensätzen (n) (z.B. 3n, 4n usw.). |
| Prüfchemikalie: | Stoff oder Gemisch, der/das mit dieser Prüfmethode untersucht wird. |
| Strukturelle Aberration: | Veränderung der Chromosomenstruktur, nachweisbar durch mikroskopische Untersuchung des Metaphase-Stadiums der Zellteilung, äußert sich in Form von Deletionen und Fragmenten, Austauschen. |
| UVCB: | Chemische Stoffe mit unbekannter oder schwankender Zusammensetzung, komplexe Reaktionsprodukte oder biologische Materialien. |
| Zentromer: | Region(en) eines Chromosoms, an die während der Zellteilung die Spindelfasern anhaften, wodurch die ordnungsgemäße Beförderung der Tochterchromosomen zu den Polen der Tochterzellen ermöglicht wird. |
B.25 In-vivo-Säuger-Translokationstest 23
Diese Prüfmethode wurde gestrichen, da sie nicht mehr für die Gewinnung von Informationen über die toxikologischen Eigenschaften von Chemikalien für die Zwecke der Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 als geeignet anerkannt ist. Die anzuwendenden Prüfmethoden für den betreffenden Endpunkt sind in Teil 0 Tabelle 2 aufgeführt.
| 1. Methode
1.1 Einleitung Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B. 1.2 Definitionen Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B. 1.3 Bezugssubstanzen Keine. 1.4 Prinzip der Methode Mit dem Translokationstest der Maus lassen sich strukturelle und numerische Chromosomenveränderungen, die in Säugetier-Keimzellen auftreten, unter Nachkommen der ersten Generation ermitteln. Bei den beobachteten Chromosomenveränderungen handelt es sich um reziproke Translokationen und - bei weiblichen Nachkommen - um X-Chromosomenverlust. Träger von Translokationen und XO-Weibchen weisen eine verringerte Fertilität auf, die man zur Auswahl von F1-Nachkommen für die zytogenetische Analyse nutzt. Bestimmte Translokationstypen (X-Autosomentranslokation und Zentromer-/Telomer-Translokation) verursachen vollständige Sterilität. Translokationen werden zytogenetisch in meiotischen Zellen in der Diakinese-Metaphase I männlicher Tiere (entweder F1-Männchen oder Söhne von F1-Weibchen) beobachtet. Die XO-Weibchen lassen sich zytogenetisch aufgrund der Anwesenheit von 39 statt 40 Chromosomen in Knochenmarksmitosen identifizieren. 1.5 Qualitätskriterien Keine. 1.6 Beschreibung der Methode Vorbereitung Die Prüfsubstanz wird in isotonischer Kochsalzlösung gelöst. Wasserunlösliche Substanzen werden in geeigneten Lösungsmitteln gelöst oder suspendiert. Es sind frisch zubereitete Lösungen oder Suspensionen der Prüfsubstanzen zu verwenden. Wird zur Erleichterung der Dosierung ein Lösungsmittel verwendet, darf dieses weder die Wirkung der Prüfsubstanz beeinträchtigen noch eine toxische Wirkung ausüben. Verabreichungsweg Die Prüfsubstanz wird normalerweise per os oder intraperitoneal verabreicht. Auch andere Verabreichungswege können geeignet sein. Versuchstiere Die Versuche werden an Mäusen durchgeführt, da deren Zucht und zytologische Untersuchung relativ einfach sind. Ein bestimmter Stamm ist nicht vorgeschrieben. Bei Anwendung der Fertilitätsuntersuchung sollte jedoch die durchschnittliche Wurfgröße des verwendeten Stammes mehr als acht Junge betragen und relativ konstant sein. Es werden gesunde, geschlechtsreife Tiere verwendet. Anzahl der Tiere Die erforderliche Anzahl der Versuchstiere hängt von der spontanen Translokationshäufigkeit und der für ein positives Ergebnis erforderlichen Erhöhung der Translokationshäufigkeit ab. Normalerweise umfasst der Test die Untersuchung der männlichen F1-Nachkommen. Pro Dosierungsgruppe sind mindestens 500 männliche F1-Nachkommen zu testen. Werden auch weibliche F1-Nachkommen berücksichtigt, sind 300 Männchen und 300 Weibchen erforderlich. Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen Geeignete Daten gleichzeitig durchgeführter und historischer Kontrollen sollten vorliegen. Stehen Ergebnisse von Positivkontrollen zur Verfügung, die in letzter Zeit im selben Labor erhoben wurden, so können diese Ergebnisse anstelle einer gleichzeitigen Positivkontrolle verwendet werden. Dosierung Getestet wird eine Dosierung. Dabei handelt es sich normalerweise um die höchste Dosis, die eine minimale toxische Wirkung ausübt, ohne jedoch das reproduktive Verhalten oder die Überlebensrate der behandelten Tiere zu beeinträchtigen. Zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Beziehung sind zwei zusätzliche niedrigere Dosierungen erforderlich. Bei nichttoxischen Substanzen sollte die Behandlung mit der höchstmöglichen Dosierung erfolgen. Versuchsdurchführung Behandlung und Paarung Es stehen zwei Behandlungspläne zur Verfügung. Am häufigsten wird die einmalige Verabreichung der Prüfsubstanz gewählt. Auch die Verabreichung an 7 Tagen/Woche während 35 Tagen ist möglich. Die Anzahl der Paarungen nach der Behandlung richtet sich nach dem gewählten Behandlungsplan; es ist sicherzustellen, dass alle behandelten Keimzellstadien erfasst werden. Nach dem Ende der Paarungsperiode werden die Weibchen einzeln in Käfigen untergebracht. Für jeden Wurf werden Geburtsdatum, Wurfgröße und Geschlecht der Jungen aufgezeichnet. Alle männlichen Jungen werden abgesetzt, alle weiblichen Jungen ausgesondert, sofern sie nicht in dem Versuch verwendet werden. Untersuchung auf Translokationsheterozygotie Es stehen zwei Verfahren zur Auswahl:
2. Daten Die Daten werden in tabellarischer Form dargestellt. Für jeden Paarungsabschnitt sind die durchschnittliche Wurfgröße und das Geschlechtsverhältnis bei der Geburt und beim Absetzen anzugeben. Die Angaben der Fertilitätsuntersuchung von F1-Tieren müssen die durchschnittliche Wurfgröße aus allen normalen Paarungen und die jeweiligen Wurfgrößen bei F1-Translokationsträgern umfassen. Zur Analyse des Uterininhalts sind die durchschnittliche Anzahl der lebenden und toten Implantate aus normalen Paarungen und die Anzahl der lebenden und toten Implantate aus jeder Paarung von F1-Translokationsträgern anzugeben. Die Angaben zur zytogenetischen Analyse der Diakinese-Metaphase I sollten für jeden Translokationsträger die Anzahl der Multivalentkonfigurationstypen sowie die Gesamtzahl der Zellen umfassen. Für sterile F1-Tiere sind die Gesamtzahl der Paarungen und die Dauer der Paarungsperiode anzugeben, ebenso die Hodengewichte und nähere Einzelheiten über die zytogenetische Analyse. Für XO-Weibchen sind die durchschnittliche Wurfgröße, das Geschlechtsverhältnis unter den F2-Nachkommen und die Ergebnisse der zytogenetischen Analyse aufzuführen. Erfolgt eine Vorauswahl möglicher F1-Translokationsträger aufgrund von Fertilitätsuntersuchungen, müssen die Tabellen auch Angaben darüber enthalten, bei wie vielen dieser Tiere die Translokationsheterozygotie bestätigt wurde. Auch die Daten aus Negativkontrollen und die Positivkontrollversuche sind anzuführen. 3. Abschlussbericht 3.1 Prüfbericht Im Prüfbericht ist, wenn möglich, Folgendes anzugeben:
3.2 Interpretation Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B. 4. Literatur Siehe allgemeine Einleitung zu Teil B. |
B.26 Prüfung auf subchronische orale Toxizität - 90-Tage-Toxizitätsstudie bei wiederholter oraler Verabreichung an Nagetieren 23
Die vollständige Beschreibung dieser Prüfmethode wurde gestrichen.
Die gleichwertige internationale Prüfmethode ist in Teil 0 Tabelle 2 aufgeführt.
| 1. Methode
Diese Methode zur Prüfung auf subchronische orale Toxizität entspricht der OECD TG 408 (1998). 1.1 Einleitung Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines chemischen Stoffs kann die Bestimmung der subchronischen Toxizität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben durchgeführt werden, nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prüfungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests auf Toxizität bei wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie liefert Informationen über mögliche gesundheitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen längeren Zeitraum, einschließlich der Entwicklung nach dem Abstillen bis zum Erwachsensein, entstehen können. Die Studie liefert ferner Informationen über die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Akkumulation auf und kann zur Ableitung einer NOAEL (NOAEL - Dosis ohne beobachtete schädigende Wirkung) beitragen, die zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chronischen Toxizität und zur Festlegung von Sicherheitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann. Die Methode legt außerdem den Schwerpunkt auf neurologische Endpunkte und liefert Hinweise auf immunologische und fortpflanzungsspezifische Wirkungen. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Beobachtung der Tiere hervorgehoben, um möglichst umfangreiche Informationen zu erhalten. Durch diese Studie sollten chemische Stoffe mit potenzieller neurotoxischer und immunologischer Wirkung sowie Wirkung auf die Fortpflanzungsorgane ermittelt werden, die gegebenenfalls weitergehende Untersuchungen erforderlich machen. Siehe auch allgemeine Einleitung zu Teil B. 1.2 Begriffsbestimmungen Dosis ist die Menge der verabreichten Prüfsubstanz. Die Dosis wird als Gewicht (g, mg) oder als Gewicht der Prüfsubstanz je Gewichtseinheit des Versuchstiers (z.B. mg/kg) oder als konstante Futterkonzentration (ppm) ausgedrückt. Dosierung ist ein allgemeiner Begriff, der die Dosis, ihre Häufigkeit und die Dauer der Verabreichung umfasst. NOAEL ist die Abkürzung für "noobservedadverseeffect level" und entspricht der höchsten Dosis, bei der keine schädigenden behandlungsbedingten Wirkungen festgestellt werden. 1.3 Prinzip der Methode Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in abgestuften Dosen an mehrere Gruppen von Versuchstieren verabreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Verabreichungszeitraums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzeichen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder getötete Tiere werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden Tiere getötet und ebenfalls seziert. 1.4 Beschreibung der Methode 1.4.1 Vorbereitung der Tiere Zu verwenden sind gesunde Tiere, die mindestens fünf Tage an die Laborbedingungen gewöhnt und bisher nicht für Tierversuche verwendet wurden. Von den Versuchstieren sollten Art, Stamm, Herkunft, Geschlecht, Gewicht und/oder Alter festgestellt werden. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in Kontroll- und Behandlungsgruppen eingeteilt. Die Käfige sind so aufzustellen, dass etwaige durch den Standort bedingte Auswirkungen so gering wie möglich sind. Jedes Versuchstier sollte zur sicheren Identifizierung eine eigene Nummer erhalten. 1.4.2 Zubereitung der Dosen Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder dem Trinkwasser verabreicht. Die Methode der oralen Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab. Die Prüfsubstanz wird über eine Magensonde, mit der Nahrung oder dem Trinkwasser verabreicht. Die Methode der oralen Verabreichung hängt von dem Zweck der Studie und den physikalischen/chemischen Eigenschaften des Prüfmaterials ab. 1.4.3 Prüfbedingungen 1.4.3.1 Versuchstiere Die bevorzugte Nagetierart ist die Ratte, doch können als Versuchstiere auch andere Nagetierarten, z.B. die Maus, verwendet werden. Es sind junge, gesunde und ausgewachsene Tiere üblicher Laborstämme zu verwenden. Die weiblichen Tiere dürfen weder geworfen haben noch trächtig sein. Mit der Dosierung sollte möglichst bald nach der Entwöhnung begonnen werden, auf jeden Fall jedoch, bevor die Tiere neun Wochen alt sind. Bei Beginn der Studie sollten die Gewichtsunterschiede der Tiere möglichst gering sein und ± 20 % des geschlechtsspezifischen Durchschnittsgewichts nicht überschreiten. Wenn die Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über chronische Toxizität durchgeführt wird, sollten in beiden Studien Tiere desselben Stamms und derselben Herkunft verwendet werden. 1.4.3.2 Zahl und Geschlecht der Versuchstiere Für jede Dosisstufe sind mindestens 20 Tiere (10 weibliche und 10 männliche) zu verwenden. Sollen im Verlauf der Prüfung Tiere getötet werden, ist die Zahl der Tiere um die Zahl zu erhöhen, die bereits vor Abschluss der Studie getötet werden sollen. Aufgrund bereits bekannter Wirkungen des chemischen Stoffs oder eines eng verwandten Analogons sollte darüber hinaus für die Kontrollgruppe und die Gruppe mit der höchsten Dosis die Aufnahme einer Satellitengruppe von 10 Tieren (fünf jeden Geschlechts) zwecks Behandlung und anschließender Beobachtung der Reversibilität oder Persistenz etwaiger toxischer Wirkungen erwogen werden. Die Dauer dieses Zeitraums nach der Behandlung sollte den beobachteten Wirkungen angemessen sein. 1.4.3.3 Dosierung Es sollten mindestens drei Dosierungen und eine gleichzeitige Kontrolle verwendet werden, es sei denn, ein Limit-Test wird durchgeführt (siehe 1.4.3.4). Die Dosierungen können auf der Grundlage der Ergebnisse von Studien mit wiederholter Verabreichung oder Studien zur Ermittlung des Dosisbereichs festgelegt werden und sollten sämtliche für die Prüfsubstanz oder verwandte Materialien verfügbaren toxikologischen und toxikokinetischen Daten berücksichtigen. Außer wenn dies wegen der physikalischchemischen Eigenschaften oder der biologischen Wirkungen der Prüfsubstanz unmöglich ist, sollte die höchste Dosierung gewählt werden, um Toxizität, jedoch nicht Tod oder schweres Leiden der Tiere zu induzieren. Zum Nachweis dosisabhängiger Reaktionen und einer NOAEL bei niedrigster Dosierung, sollten die Dosierungen in absteigender Folge verabreicht werden. Zwei- bis vierfache Abstände haben sich oft als optimale Dosisabstufungen erwiesen, auch ist meist eine vierte Testgruppe der Anwendung sehr großer Dosisabstände (z.B. mehr als ein Faktor von ca. 6-10) vorzuziehen. Die Kontrollgruppe sollte eine unbehandelte Gruppe oder eine Vehikelkontrollgruppe sein, sofern ein Vehikel zur Verabreichung der Prüfsubstanz verwendet wird. Abgesehen von der Behandlung mit der Prüfsubstanz sollten die Tiere der Kontrollgruppe identisch mit denen der Testgruppen behandelt werden. Wird ein Vehikel verwendet, erhält die Kontrollgruppe das Vehikel im höchsten verwendeten Volumen. Wird eine Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht, und führt dies zu einer verminderten Futteraufnahme, kann eine paarweise gefütterte Kontrollgruppe nützlich sein, wobei zwischen einer verminderten Futteraufnahme aus geschmacklichen Gründen oder wegen toxikologischer Veränderungen im Prüfmodell unterschieden wird. Zu berücksichtigen sind gegebenenfalls folgende Merkmale des Vehikels und anderer Additive: Wirkungen auf die Absorption, die Verteilung, den Stoffwechsel oder die Retention der Prüfsubstanz; Wirkungen auf die chemischen Eigenschaften der Prüfsubstanz, die zur Änderung von toxischen Eigenschaften führen können; ferner Wirkungen auf die Futter- oder Wasseraufnahme oder den Ernährungszustand der Versuchstiere. 1.4.3.4 Limit-Test Ergibt eine Prüfung bei einer einzigen Dosis von mindestens 1.000 mg/kg Körpergewicht/Tag unter Anwendung der für diese Studie beschriebenen Verfahren keine adversen Effekte und ist aufgrund der Daten strukturverwandter Stoffe keine Toxizität zu erwarten, kann auf eine vollständige Studie mit drei Dosisstufen gegebenenfalls verzichtet werden. Der Limit-Test ist anzuwenden, außer wenn die Expositionswirkungen beim Menschen die Prüfung bei einer höheren Dosis erforderlich erscheinen lässt. 1.5 Versuchsdurchführung 1.5.1 Verabreichung der Dosen Die Versuchstiere erhalten die Prüfsubstanz an sieben Tagen der Woche über einen Zeitraum von 90 Tagen. Jede Abweichung von diesem Dosierungsplan, z.B. fünf Tage je Woche, ist zu begründen. Wird die Prüfsubstanz über eine Sonde verabreicht, so sollte dies in einer einmaligen Dosis unter Verwendung einer Magensonde oder einer geeigneten Intubationskanüle erfolgen. Das maximale Flüssigkeitsvolumen, das einem Versuchstier mit einer Gabe verabreicht werden kann, hängt von der Größe des Versuchstiers ab. Das Volumen sollte 1 ml/100g Körpergewicht nicht überschreiten, außer bei wässrigen Lösungen, von denen 2 ml/100g Körpergewicht gegeben werden können. Außer für Reizungen auslösende oder ätzende Stoffe, die in der Regel bei höheren Konzentrationen eine Verschlimmerung bewirken, sollte die Variabilität des Prüfvolumens durch Anpassung der Konzentration möglichst gering gehalten werden, um ein konstantes Volumen bei allen Dosen zu gewährleisten. Für mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabreichte Stoffe ist unbedingt sicherzustellen, dass die Mengen der jeweiligen Prüfsubstanz die normale Nahrungsaufnahme oder den Wasserhaushalt nicht beeinträchtigen. Wenn die Prüfsubstanz mit dem Futter verabreicht wird, können entweder eine konstante Futterkonzentration (ppm) oder eine konstante Dosierung in Relation zum Körpergewicht des Versuchstiers verwendet werden. Die angewandte Alternative ist zu spezifizieren. Eine mit einer Magensonde verabreichte Dosis sollte jeweils zu denselben Tageszeiten gegeben und so angepasst werden, dass eine konstante Dosis in Relation zum Körpergewicht aufrechterhalten wird. Wird eine 90-Tage-Studie als Vorstudie für eine Langzeitstudie über chronische Toxizität verwendet, sollte in beiden Studien die gleiche Nahrung gegeben werden. 1.5.2 Beobachtungen Der Beobachtungszeitraum sollte mindestens 90 Tage betragen. Tiere einer Satellitengruppe, die für Nachfolgebeobachtungen vorgesehen sind, sollten für einen angemessenen Zeitraum ohne Behandlung bleiben, um festzustellen, ob die toxischen Wirkungen fortbestehen oder sich als reversibel erweisen. Allgemeine klinische Beobachtungen sollten mindestens einmal täglich, vorzugsweise zur selben Tageszeit, unter Berücksichtigung des Zeitraums, in dem der Wirkungsgipfel nach Verabreichung der Dosis zu erwarten ist, vorgenommen werden. Der klinische Zustand der Tiere ist zu dokumentieren. Alle Tiere sind mindestens zweimal täglich, in der Regel morgens und abends, auf Anzeichen von Morbidität und Mortalität hin zu untersuchen. Mindestens einmal vor der ersten Exposition (für intraindividuelle Vergleiche) und danach einmal pro Woche sollten bei allen Tieren eingehende klinische Beobachtungen vorgenommen werden. Diese Beobachtungen sollten außerhalb des Käfigs erfolgen, in dem die Tiere gehalten werden, und zwar vorzugsweise in einem Standardgehege jeweils zu denselben Zeiten. Sie sind sorgfältig zu dokumentieren, am besten nach einer speziell vom Prüflabor entwickelten Bewertungsskala. Es ist dafür zu sorgen, dass die Beobachtungsbedingungen möglichst konstant bleiben. Die Beobachtungen sollten sich insbesondere beziehen auf Veränderungen an Haut, Fell, Augen, Schleimhäuten, auf Sekrete und Exkrete sowie auf autonome Reaktionen (z.B. Tränenfluss, Piloerektion, Pupillengröße, anormale Atmung). Gang- und Haltungsstörungen, ferner Reaktionen auf den Umgang mit den Tieren sowie etwaige klonische oder tonische Bewegungen, Stereotypien (z.B. übermäßiges Putzen, wiederholte Kreisbewegungen) oder abnormes Verhalten (z.B. Selbstverstümmelung, Rückwärtsgehen) sollten auch dokumentiert werden (1). Ophthalmologische Untersuchungen unter Verwendung eines Ophthalmoskops oder eines entsprechenden geeigneten Geräts sollten vorgenommen werden, bevor die Prüfsubstanz verabreicht wird, sowie zum Abschluss der Studie, vorzugsweise an allen Tieren, doch zumindest in den höchstdosierten Gruppen und den Kontrollgruppen. Sofern Veränderungen an den Augen beobachtet werden, sollten alle Tiere untersucht werden. Zum Ende des Expositionszeitraums, jedenfalls nicht früher als in der 11. Woche, sollten sensorische Reaktionen auf Reize verschiedener Art (1) (z.B. akustische, visuelle und propriozeptive Reize) (2) (3) (4) sowie die Greifstärke (5) und die motorische Aktivität (6) erfasst werden. Weitere Einzelheiten zu den möglichen Untersuchungen finden sich in der Literatur. Allerdings können auch andere als dort genannte Verfahren angewendet werden. Funktionelle Beobachtungen zum Abschluss der Studie können entfallen, wenn Daten über funktionelle Beobachtungen aus anderen Studien vorliegen und die täglichen klinischen Beobachtungen keine Funktionsdefizite aufweisen. In Ausnahmefällen können funktionelle Beobachtungen auch bei Gruppen entfallen, die so starke sonstige Toxizitätsanzeichen aufweisen, dass die Leistungen in Funktionstests dadurch signifikant beeinträchtigt würden. 1.5.2.1 Körpergewicht und Futter-/Wasseraufnahme Alle Tiere sollten mindestens einmal wöchentlich gewogen werden. Messungen der Futteraufnahme sollten mindestens wöchentlich vorgenommen werden. Wenn die Prüfsubstanz über das Trinkwasser verabreicht wird, sollte auch die Wasseraufnahme mindestens einmal wöchentlich gemessen werden. Die Wasseraufnahme kann auch in Fütterungsstudien oder in Studien mit Sondenapplikation berücksichtigt werden, bei denen sich das Trinkverhalten ändern kann. 1.5.2.2 Hämatologische und klinischbiochemische Untersuchungen Die Blutproben sind an einer zu benennenden Stelle zu entnehmen und möglichst unter geeigneten Bedingungen zu lagern. Am Ende des Prüfzeitraums werden bei den Versuchstieren Blutproben kurz vor der Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen. Folgende hämatologische Untersuchungen sind am Ende des Prüfzeitraums und bei etwaigen zwischenzeitlich entnommenen Blutproben durchzuführen: Hämatokritwert, Hämoglobinkonzentration, Erythrozytenzahl, Leukozytenzahl (Gesamt- und Differenzialblutbild), Thrombozytenzahl und Messung der Blutgerinnungszeit/ Blutgerinnungsfähigkeit. Klinischbiochemische Bestimmungen zur Untersuchung der wichtigsten toxischen Wirkungen in Geweben, insbesondere der Wirkungen auf Nieren und Leber, sind an Blutproben durchzuführen, die von jedem Tier unmittelbar vor der Tötung oder als Teil des Tötungsvorgangs entnommen werden (dies gilt nicht für Tiere, die sterbend aufgefunden und/oder zwischenzeitlich getötet werden). Vergleichbar zu den hämatologischen Untersuchungen können klinischbiochemische Untersuchungen bei den zwischenzeitlich entnommenen Blutproben durchgeführt werden. Es empfiehlt sich eine Futterkarenz der Tiere über Nacht, bevor die Blutproben entnommen werden 1. Die Plasma- oder Serumbestimmungen umfassen die Parameter Natrium, Kalium, Glukose, Gesamtcholesterin, Harnstoff, Harnstoff-Stickstoff im Blut, Kreatinin, Gesamtprotein und Albumin sowie mehr als zwei Enzyme, die auf hepatozelluläre Wirkungen (wie Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase, alkalische Phosphatase, Gammaglutamyl-Transpeptidase und Sorbitoldehydrogenase) schließen lassen. Ferner kann die Bestimmung weiterer Enzyme (der Leber oder sonstiger Organe) und der Gallensäuren, die unter bestimmten Bedingungen ebenfalls nützliche Informationen liefern, durchgeführt werden. Optional können in der letzten Woche der Studie am Urin, der zu festgelegten Zeiten gesammelt wird, folgende Analysebestimmungen durchgeführt werden: Aussehen, Volumen, Osmolalität oder spezifisches Gewicht, pH-Wert, Eiweiß, Glukose und Blut/Blutzellen. Darüber hinaus sollten Untersuchungen zur Bestimmung von Serummarkern für eine allgemeine Gewebsschädigung erwogen werden. Des Weiteren sollten, wenn die bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz die entsprechenden Stoffwechselprofile beeinträchtigen können oder wenn mit einer solchen Beeinträchtigung zu rechnen ist, die Parameter Calcium, Phosphor, Nüchterntriglyzeride, spezifische Hormone, Methämoglobin und Cholinesterase bestimmt werden. Die jeweiligen Parameter sind je nach Prüfsubstanzklasse bzw. von Fall zu Fall zu bestimmen. Insgesamt jedoch ist je nach der Versuchstierart und den beobachteten und/oder erwarteten Wirkungen der Prüfsubstanz mit der entsprechenden Flexibilität vorzugehen. Bei unzureichender Datenlage zu den Normalwerten sollte die Bestimmung hämatologischer und klinischbiochemischer Parameter gegebenenfalls auch vor Verabreichung der Prüfsubstanz erwogen werden. In der Regel empfiehlt es sich nicht, diese Daten vor der Behandlung zu bestimmen (7). 1.5.2.3 Autopsie Alle an der Studie beteiligten Tiere müssen einer vollständigen, eingehenden Autopsie unterzogen werden, die die sorgfältige Untersuchung der äußeren Körperoberfläche, aller Körperöffnungen sowie der Schädel-, Brust- und Bauchhöhlen und ihres Inhalts umfasst. Leber, Nieren, Nebennieren, Hoden, Nebenhoden, Uterus, Eierstöcke, Thymus, Milz, Gehirn und Herz aller Tiere (außer der tot aufgefundenen und/oder zwischenzeitlich getöteten Tiere) sind in angemessener Form von anhaftendem Gewebe zu befreien, und ihr Nassgewicht ist so rasch wie möglich nach der Sektion festzustellen, um ein Austrocknen zu verhindern. Die folgenden Gewebe sind in dem für Gewebsarten und die vorgesehene nachfolgende histopathologische Untersuchung am besten geeigneten Fixierungsmedium aufzubewahren: alle Gewebe mit makroskopischen Läsionen, Gehirn (repräsentative Bereiche, insbesondere Cerebrum, Cerebellum und Medulla/Pons), Rückenmark (auf drei Ebenen: cervical, mittlerer Thoraxbereich, und lumbar), Hypophyse, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Thymusdrüse, Speiseröhre, Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm (einschließlich Peyer'schen Platten), Leber, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Nebennieren, Milz, Herz, Luftröhre und Lungen (durch Inflation mit Fixiermittel und anschließende Immersion konserviert), Aorta, Gonaden, Uterus akzessorische Geschlechtsorgane, weibliche Brustdrüsen, Prostata, Harnblase, Gallenblase (Maus), Lymphknoten (vorzugsweise ein Lymphknoten des Verabreichungsweges und ein weiterer vom Verabreichungsweg entfernter Lymphknoten, um systemische Wirkungen abzudecken), periphere Nerven (N. ischiadicus oder N. tibialis), vorzugsweise in der Nähe des Muskels, ein Knochenmarksschnitt (und/oder ein frisches Knochenmark-Aspirat) Haut und Augen (sofern bei den ophthalmologischen Untersuchungen Veränderungen beobachtet wurden). Die klinischen und sonstigen Befunde können weitere Gewebsuntersuchungen erforderlich machen. Auch Organe, die aufgrund der bekannten Eigenschaften der Prüfsubstanz als wahrscheinliche Zielorgane in Frage kommen, sollten aufbewahrt werden. 1.5.2.4 Histopathologische Untersuchungen Bei allen Tieren der Gruppe mit der höchsten Dosis sowie bei den Tieren der Kontrollgruppe ist eine umfassende histopathologische Untersuchung der konservierten Organe und Gewebe durchzuführen. Diese Untersuchungen sind auch auf die Tiere aller anderen Dosisgruppen auszudehnen, wenn behandlungsbedingte Veränderungen in der Gruppe mit der höchsten Dosis festgestellt werden. Alle makroskopischen Läsionen sind zu untersuchen. Umfasst eine Prüfung auch eine Satellitengruppe, sind bei den Tieren dieser Gruppe die Gewebe und Organe histopathologisch zu untersuchen, bei denen in den Behandlungsgruppen toxische Wirkungen aufgetreten sind. 2. Daten und Berichterstattung 2.1 Daten Es sollten Daten für jedes einzelne Tier vorgelegt werden. Außerdem sollten alle Daten in Tabellenform zusammengefasst werden, aus denen für jede Prüfgruppe folgende Angaben hervorgehen: die Zahl der Tiere bei Beginn der Prüfung und die Zahl der während der Prüfung tot aufgefundenen oder aus Gründen des Tierschutzes getöteten Tiere, ferner der Zeitpunkt des eingetretenen Todes oder der aus Tierschutzgründen vorgenommenen Tötung, die Zahl der Tiere, die Anzeichen von Toxizität aufweisen, eine Beschreibung der beobachteten Toxizität, einschließlich des Zeitpunkts, zu dem die toxischen Wirkungen erstmalig aufgetreten sind, deren Dauer und Schweregrad, die Zahl der Tiere mit Läsionen, die Art der Läsionen und der Prozentsatz der davon betroffenen Tiere. Wenn möglich sind die numerischen Daten durch eine geeignete allgemein annehmbare statistische Methode auszuwerten. Die statistischen Methoden und die zu analysierenden Daten sollten bei der Planung der Studie festgelegt werden. 2.2 Prüfbericht Der Prüfbericht muss folgende Angaben enthalten: 2.2.1 Prüfsubstanz
2.2.2 Versuchstierart
2.2.3 Prüfbedingungen
2.2.4 Ergebnisse
Diskussion der Ergebnisse. Schlussfolgerungen. 3. Literatur (1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. (2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. (3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704. (4) Moser. V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol 108, 267-283. (5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Foreand Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 233-236. (6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: lmplication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol, 13, 599-609. (7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al (1996). 'Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies', Fundam. & Appl. Toxicol., 29, 198-201. ... |
| weiter . | |