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Neufassung - Ersetzt die RL"n *

Die Änderung betrifft nicht die deutsche Fassung.

RL"en 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG - Entsprechungstabelle - Anwenden

Die Kommission der Europäischen Gemeinschaften -

gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft,

gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 882/2004 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 29. April 2004 über amtliche Kontrollen zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen über Tiergesundheit und Tierschutz ¹, insbesondere auf Artikel 11 Absatz 4 Buchstaben a, b und c,

in Erwägung nachstehender Gründe:

(1) Die nachstehenden Rechtsakte wurden zur Durchführung der Richtlinie 70/373/EWG erlassen und bleiben gemäß Artikel 61 Absatz 2 der Verordnung (EG) Nr. 882/2004 in Kraft:

• Erste Richtlinie 71/250/EWG der Kommission vom 15. Juni 1971 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ²,
• Zweite Richtlinie 71/393/EWG der Kommission vom 18. November 1971 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ³,
• Dritte Richtlinie 72/199/EWG der Kommission vom 27. April 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁴,
• Vierte Richtlinie 73/46/EWG der Kommission vom 5. Dezember 1972 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁵,
• Erste Richtlinie 76/371/EWG der Kommission vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Probenahmeverfahren für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁶,
• Siebte Richtlinie 76/372/EWG der Kommission vom 1. März 1976 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁷,
• Achte Richtlinie 78/633/EWG der Kommission vom 15. Juni 1978 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁸,
• Neunte Richtlinie 81/715/EWG der Kommission vom 31. Juli 1981 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ⁹,
• Zehnte Richtlinie 84/425/EWG der Kommission vom 25. Juli 1984 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ¹⁰,
• Richtlinie 86/174/EWG der Kommission vom 9. April 1986 zur Festlegung der Methode zur Berechnung des Energiegehalts von Mischfuttermitteln für Geflügel ¹¹,
• Elfte Richtlinie 93/70/EWG der Kommission vom 28. Juli 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ¹²,
• Zwölfte Richtlinie 93/117/EG der Kommission vom 17. Dezember 1993 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln ¹³,
• Richtlinie 98/64/EG der Kommission vom 3. September 1998 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Aminosäuren, Rohfetten und Olaquindox in Futtermitteln und zur Änderung der Richtlinie 71/393/EWG ¹⁴,
• Richtlinie 1999/27/EG der Kommission vom 20. April 1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Amprolium, Diclazuril und Carbadox in Futtermitteln sowie zur Änderung der Richtlinien 71/250/EWG und 73/46/EWG und zur Aufhebung der Richtlinie 74/203/EWG ¹⁵,
• Richtlinie 1999/76/EG der Kommission vom 23. Juli 1999 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Lasalocid-Natrium in Futtermitteln ¹⁶,
• Richtlinie 2000/45/EG der Kommission vom 6. Juli 2000 zur Festlegung gemeinschaftlicher Analysemethoden für die Bestimmung von Vitamin A, Vitamin E und Tryptophan in Futtermitteln ¹⁷,
• Richtlinie 2002/70/EG der Kommission vom 26. Juli 2002 zur Festlegung von Anforderungen an die Bestimmung der Gehalte an Dioxinen und dioxinähnlichen PCB in Futtermitteln ¹⁸,
• Richtlinie 2003/126/EG der Kommission vom 23. Dezember 2003 über die Analysemethode zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln ¹⁹.

(2) Da die Richtlinie 70/373/EWG durch die Verordnung (EG) Nr. 882/2004 ersetzt wurde, ist es angezeigt, die Durchführungsrechtsakte zu dieser Richtlinie aufzuheben und in einer einzigen Verordnung zusammenzufassen. Gleichzeitig sollten die Methoden und Verfahren entsprechend den neuesten wissenschaftlichen und technologischen Erkenntnissen angepasst werden. Methoden, die zu ihrem Zweck nicht mehr verwendet werden, sollten gestrichen werden. Es ist geplant, die Probenahmebestimmungen zu gegebener Zeit zu aktualisieren, um den jüngsten Entwicklungen bei der Erzeugung, Lagerung, Beförderung und Vermarktung von Futtermitteln Rechnung zu tragen. Dennoch ist es angezeigt, die bestehenden Probenahmebestimmungen vorläufig beizubehalten.

(3) Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG sollten daher aufgehoben werden.

(4) Die in dieser Verordnung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Ausschusses für die Lebensmittelkette und Tiergesundheit

- hat folgende Verordnung erlassen:

Artikel 1 ^{13 24}

Die Probenahmen für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln, insbesondere auf ihre Bestandteile, eingeschlossen Material, das genetisch veränderte Organismen (GVO) enthält, aus ihnen besteht oder aus ihnen hergestellt ist, Futtermittelzusatzstoffe gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1831/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates ²⁰ und unerwünschte Stoffe gemäß der Richtlinie 2002/32/EG des Europäischen Parlaments und des Rates ²¹, erfolgen mit Ausnahme der Probenahme für die Untersuchung auf mikrobiologische Kontamination nach den in Anhang I aufgeführten Verfahren.

Das in Anhang I beschriebene Probenahmeverfahren gilt für die Untersuchung von Futtermitteln auf Pflanzenschutzmittelrückstände gemäß der Verordnung (EG) Nr. 396/2005 des Europäischen Parlaments und des Rates ²² und für die Überprüfung der Einhaltung der Verordnung (EU) Nr. 619/2011.

Artikel 2

Die Vorbereitung der Analyseproben und die Formulierung der Ergebnisse erfolgen nach den in Anhang II aufgeführten Methoden.

Artikel 3

Die Analyse für die amtliche Untersuchung von Futtermitteln erfolgt nach den Methoden, die in Anhang III(Analysemethoden zur Untersuchung der Zusammensetzung von Futtermittel-Ausgangserzeugnissen und Mischfuttermitteln), Anhang IV (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf ihren Gehalt an zugelassenen Zusatzstoffen), Anhang V (Analysemethoden zur Untersuchung von Futtermitteln auf unerwünschte Stoffe) und Anhang VI (Analysemethoden zur Bestimmung der Bestandteile tierischen Ursprungs bei der amtlichen Untersuchung von Futtermitteln) aufgeführt sind.

Artikel 4

Der Energiegehalt von Mischfuttermitteln für Geflügel wird in Übereinstimmung mit Anhang VII berechnet.

Artikel 5

Die in Anhang VIII aufgeführten Analysemethoden für die Untersuchung auf rechtswidriges Vorhandensein von nicht mehr zugelassenen Zusatzstoffen in Futtermitteln werden zu Bestätigungszwecken verwendet.

Artikel 6

Die Richtlinien 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG und 2003/126/EG werden aufgehoben.

Verweise auf die aufgehobenen Richtlinien gelten als Verweise auf die vorliegende Verordnung nach den Entsprechungstabellen in Anhang IX.

Artikel 7

Diese Verordnung tritt am zwanzigsten Tag nach ihrer Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Union in Kraft.

Sie gilt ab dem 26. August 2009.

Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitgliedstaat.

Brüssel, den 27. Januar 2009

1. Zweck und Anwendungsbereich

Die zur amtlichen Untersuchung bestimmten Futtermittelproben werden gemäß den nachstehenden Verfahren entnommen. Die so gewonnenen Proben gelten als repräsentativ für die Teilpartien.

Zweck der repräsentativen Beprobung ist es, einen kleinen Teil einer Partie zu untersuchen und durch die Bestimmung eines spezifischen Merkmals bei diesem Teil den Durchschnittswert des Merkmals für die gesamte Partie zu ermitteln. Die Partie wird mittels wiederholter Entnahme von Einzelproben an verschiedenen Stellen der Partie untersucht. Diese Einzelproben werden zu einer Sammelprobe gemischt, aus der durch repräsentative Teilung repräsentative Endproben herzustellen sind.

Wenn bei der Sichtprüfung oder aufgrund anderer einschlägiger Informationen Teile des zu beprobenden Futtermittels einen Qualitätsunterschied zum übrigen Futtermittel derselben Partie aufweisen, werden diese Teile vom übrigen Futtermittel abgesondert und als getrennte Teilpartie behandelt. Ist eine Aufteilung des Futtermittels in getrennte Teilpartien nicht möglich, so wird das Futtermittel als eine einzige Partie beprobt. In solchen Fällen ist dies im Probenahmebericht zu vermerken.

Ist ein Futtermittel, das gemäß den Bestimmungen der vorliegenden Verordnung beprobt wurde und nachweislich die EU-Anforderungen nicht erfüllt, Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

Auch Futtermittel, die gemäß Artikel 11 Absatz 3 der Verordnung (EG) Nr. 767/2009 des Europäischen Parlaments und des Rates ¹ über eine Fernkommunikationstechnik zum Verkauf angeboten werden, können beprobt werden. Die Beprobung von Futtermitteln, die über eine Fernkommunikationstechnik zum Verkauf angeboten werden, unterliegt grundsätzlich den in diesem Anhang dargelegten Punkten. Spezifische Aspekte der Beprobung über Fernkommunikation angebotener Futtermittel werden in Nummer 11 beschrieben.

2. Begriffsbestimmungen

• Partie (oder Charge): identifizierbare Menge an Futtermitteln, die nachweislich gemeinsame Eigenschaften haben, wie Ursprung, Sorte, Art der Verpackung, Verpacker, Übersender oder Kennzeichnung; im Falle eines Herstellungsverfahrens bezeichnet "Partie" eine Einheit der Herstellung aus einer einzigen Anlage unter Verwendung einheitlicher Herstellungsparameter oder eine Reihe solcher Einheiten, sofern sie in kontinuierlicher Reihenfolge hergestellt und zusammen gelagert werden.
• Teilpartie: Partie oder identifizierbare Teilmenge der Partie bzw. Teilpartie.
• Verplombte Probe: Probe, die solchermaßen mit einer Plombe verschlossen wurde, dass kein Zugriff auf sie möglich ist, ohne die Plombe zu beschädigen oder zu entfernen.
• Einzelprobe: Menge, die an einer Stelle der Teilpartie entnommen wird.
• Sammelprobe: Gesamtmenge der aus derselben Teilpartie entnommenen Einzelproben.
• Reduzierte Probe: Teilmenge der Sammelprobe, die aus letzterer durch repräsentative Reduktion gewonnen wird.
• Endprobe: Teilmenge der Sammelprobe (vermischt), der reduzierten Probe oder der homogenisierten Sammelprobe, je nach Art der Kontrolle (siehe Nummer 9.4).
• Laborprobe: für das Labor bestimmte (beim Labor eingegangene) Probe, bei der es sich um die Endprobe, die reduzierte Probe oder die Sammelprobe handeln kann.
• Probe aus dem Fernabsatz: Probe einer Futtermittelpartie oder -charge, die über Fernkommunikationstechnik zum Verkauf angeboten wird.

3. Allgemeine Bestimmungen

• Die Probenahme erfolgt durch die von der zuständigen Behörde zu diesem Zweck bevollmächtigten Personen.
• Um eine Probe aus dem Fernabsatz zu erhalten, fordert die zuständige Behörde über Fernkommunikationstechnik eine Futtermittelmenge vom Futtermittelunternehmer an.
• Die Probe muss so verplombt werden, dass kein Zugriff auf sie möglich ist, ohne die Plombe zu beschädigen oder zu entfernen.

Der Plombenstempel sollte eindeutig identifizierbar und gut sichtbar sein.

• Identifizierung der Probe: Die Probe muss mit einer dauerhaften Kennzeichnung versehen und so identifiziert werden, dass eine eindeutige Verbindung zum Probenahmebericht besteht.
• Aus jeder Sammelprobe oder jeder reduzierten Probe werden die folgenden Endproben entnommen: eine Probe zur Kontrolle (Vollzug) und eine für den Futtermittelunternehmer (Gegenprobe). Gegebenenfalls kann eine weitere Endprobe zu Referenzzwecken entnommen werden. Im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe werden die Endproben aus der homogenisierten Sammelprobe entnommen, es sei denn, dass dieses Verfahren den Vorschriften der Mitgliedstaaten hinsichtlich der Rechte des Futtermittelunternehmers zuwiderläuft.
• Gemäß Artikel 15 Absätze 1 und 2 der Verordnung (EU) 2017/625 müssen die Futtermittelunternehmer, soweit dies für die Durchführung amtlicher Kontrollen erforderlich ist, auf Verlangen der zuständigen Behörden:
  • dem Personal der zuständigen Behörden Zugang zu der Ausrüstung unter ihrer Verantwortung ermöglichen, was - falls erforderlich - die Bereitstellung der Ausrüstung für die Probenahme und der persönlichen Schutzausrüstung umfasst,
  • das Personal der zuständigen Behörden unterstützen und mit ihm zusammenarbeiten, um die Probenahme zu ermöglichen, was auch einschließt, die Futtermittel dem Personal der zuständigen Behörden zugänglich zu machen.

4. Geräte

4.1. Die Geräte zur Probenahme müssen aus Materialien bestehen, die die zu beprobenden Erzeugnisse nicht kontaminieren können. Geräte, die für eine mehrfache Anwendung vorgesehen sind, müssen leicht zu reinigen sein, damit eine Kreuzkontamination vermieden wird.

4.2. Empfohlene Geräte für die Probenahme fester Futtermittel

4.2.1. Manuelle Probenahme

4.2.1.1. Probenahmeschaufel mit ebenem Boden und rechteckig hochgebogenem Rand.

4.2.1.2. Probenahmestab mit langem Schlitz oder Kammern. Die Dimensionierung des Probenahmestabes ist den Merkmalen der Teilpartie (Tiefe des Behälters, Größe des Sacks usw.) und der Partikelgröße des Futtermittels anzupassen.

Falls es sich um einen Probenahmestab mit mehreren Öffnungen handelt, sollten diese durch Kammern oder fortlaufend versetzte Öffnungen voneinander getrennt sein, damit sichergestellt ist, dass die Probe an verschiedenen Stellen entlang des Probenahmestabes entnommen wird.

4.2.2. Mechanische Probenahme

Geeignete mechanische Geräte dürfen zur Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln verwendet werden. Ein mechanisches Gerät gilt als geeignet, wenn mindestens der gesamte Fließquerschnitt beprobt wird.

Die Probenahme aus in Bewegung befindlichen Futtermitteln (bei hohen Durchflussraten) kann mittels automatischer Probenehmer erfolgen.

4.2.3. Probenteiler

Soweit möglich und sinnvoll, sollten zur Herstellung reduzierter Proben Geräte verwendet werden, die zur Zerlegung der Probe in ungefähr gleiche Teile in repräsentativer Form bestimmt sind.

5. Quantitative Anforderungen hinsichtlich der Anzahl von Einzelproben

• Die in den Nummern 5.1. und 5.2. genannten quantitativen Anforderungen hinsichtlich der Anzahl von Einzelproben gelten für Teilpartien bis zu 500 t, die einer repräsentativen Probenahme unterzogen werden können. Das beschriebene Probenahmeverfahren gilt in gleicher Weise für Mengen, die die festgelegte maximale Teilpartie überschreiten, sofern die in den nachstehenden Tabellen unter den Nummern 5.1.1., 5.1.3. und 5.1.5. vorgegebene Höchstanzahl der Einzelproben außer Acht gelassen wird und stattdessen die Anzahl der Einzelproben anhand der Quadratwurzelformel für den entsprechenden Verfahrensabschnitt (siehe Nummer 5.3.) bestimmt und die Mindestgröße der Sammelprobe proportional erhöht wird. Ungeachtet dessen kann eine große Partie in kleinere Teilpartien aufgeteilt und jede Teilpartie nach dem in den Nummern 5.1 und 5.2 beschriebenen Verfahren beprobt werden.
• Die Teilpartie muss so gewählt werden, dass eine Beprobung aller Einzelbestandteile möglich ist.
• Bei sehr großen Partien bzw. Teilpartien (> 500 t) und bei Partien, die so befördert oder gelagert werden, dass eine Probenahme gemäß dem Verfahren der Nummern 5.1 und 5.2 nicht erfolgen kann, ist das Probenahmeverfahren nach Nummer 5.3 anzuwenden.
• Handelt es sich um Proben aus dem Fernabsatz weiß die zuständige Behörde in der Regel nicht, wie groß die Partie ist, aus der die Menge angefordert wird. Aus diesem Grund kann das Verfahren nach den Nummern 5.1 und 5.2 nicht angewandt werden. Dann ist das unter Nummer 11 beschriebene Verfahren anzuwenden.
• Ist der Futtermittelunternehmer im Rahmen eines obligatorischen Überwachungssystems gesetzlich zur Einhaltung der vorliegenden Verordnung verpflichtet, so kann er von den in diesem Nummer festgelegten quantitativen Anforderungen abweichen, um funktionsspezifischen Besonderheiten Rechnung zu tragen, sofern er zur Zufriedenheit der zuständigen Behörde die Gleichwertigkeit des Probenahmeverfahrens in Bezug auf den Repräsentationsgrad nachgewiesen hat, und nachdem eine entsprechende Genehmigung seitens der zuständigen Behörde erteilt wurde.
• Ist es nicht möglich, das festgelegte Probenahmeverfahren im Hinblick auf die quantitativen Anforderungen anzuwenden, da sich aus einer Beschädigung der Partie unannehmbare Folgen für den Handel ergeben würden (wegen der Verpackungsart, der Transportweise, der Lagerungsform usw.), so kann ausnahmsweise ein alternatives Probenahmeverfahren angewandt werden, sofern dieses so repräsentativ wie möglich ist und umfassend beschrieben und dokumentiert wird.

5.1. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bezüglich der Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind

5.1.1. Feste Futtermittel in loser Form

5.1.2. Flüssige Futtermittel in loser Form

5.1.3. Verpackte Futtermittel

Futtermittel (fest und flüssig) können in Beuteln, Säcken, Dosen, Fässern usw. verpackt sein, die in der Tabelle als Einheiten bezeichnet werden. Große Einheiten (≥ 500 kg bzw. l) sind nach den Vorschriften für lose Futtermittel (siehe Nummern 5.1.1 und 5.1.2) zu beproben.

5.1.4. Futterblöcke und Lecksteine

Zu beproben ist mindestens ein Futterblock oder Leckstein je Teilpartie zu 25 Einheiten, die Höchstzahl beträgt vier Futterblöcke oder Lecksteine.

Bei Futterblöcken oder Lecksteinen mit einem Gewicht von jeweils maximal 1 kg gilt der Inhalt eines Futterblocks oder Lecksteins als Einzelprobe.

5.1.5. Raufutter/Grünfutter

5.2. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bezüglich der Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können

Diese quantitativen Anforderungen an Einzelproben gelten in folgenden Fällen:

• Untersuchung auf Aflatoxine, Mutterkorn, andere Mykotoxine und schädliche botanische Unreinheiten in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen;
• Untersuchung auf Kreuzkontamination durch einen Bestandteil, einschließlich genetisch veränderter Ausgangserzeugnisse, oder einen Stoff, bei dem eine ungleichmäßige Verteilung im Futtermittel anzunehmen ist.

Hat die Untersuchungsbehörde den starken Verdacht, dass eine solche ungleichmäßige Verteilung auch im Fall einer Kreuzkontamination durch einen Bestandteil oder einen Stoff in einem Futtermittel-Ausgangserzeugnis auftritt, so können die in der nachstehenden Tabelle festgelegten quantitativen Anforderungen gestellt werden.

5.3. Quantitative Anforderungen an Einzelproben bei sehr großen Partien

Bei großen Teilpartien (> 500 t) ist die Anzahl der zu entnehmenden Einzelproben wie folgt zu festzulegen: 40 Einzelproben + √-Tonnen für die Untersuchung auf Stoffe oder Erzeugnisse, die im gesamten Futtermittel gleichmäßig verteilt sind, oder 100 Einzelproben + √-Tonnen für die Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können.

6. Quantitative Anforderungen an Sammelproben

Je Teilpartie ist eine einzelne Sammelprobe erforderlich.

7. Quantitative Anforderungen an Endproben

Endproben

Mindestens eine Endprobe muss analysiert werden. Die Menge der zur Analyse bestimmten Endproben darf nicht unter den nachstehend festgelegten Mindestmengen liegen:

8. Probenahmeverfahren für sehr grosse Partien oder Partien, die so gelagert oder befördert werden, dass eine Beprobung der gesamten Partie nicht praktikabel ist

8.1. Allgemeine Grundsätze

Falls es die Art der Beförderung oder Lagerung einer Partie nicht gestattet, Einzelproben aus der gesamten Partie zu entnehmen, sollte die Beprobung solcher Partien vorzugsweise dann erfolgen, wenn sich die Partie im Fluss befindet.

Falls es sich um Großlager für Futtermittel handelt, sollten die Unternehmer dazu angehalten werden, Einrichtungen im Lager zu installieren, die eine (automatische) Beprobung der gesamten gelagerten Partie ermöglichen.

Im Fall der Anwendung der in diesem Punkt dargelegten Probenahmeverfahren wird der Futtermittelunternehmer oder sein Vertreter über das Probenahmeverfahren informiert. Wird dieses Probenahmeverfahren von dem Futtermittelunternehmer oder seinem Vertreter infrage gestellt, so muss dieser es der zuständigen Behörde auf Kosten des Unternehmers ermöglichen, die gesamte Partie zu beproben.

8.2. Große Partien, die per Schiff befördert werden

8.2.1. Dynamische Beprobung großer Partien, die per Schiff befördert werden

Die Beprobung großer Partien auf Schiffen ist vorzugsweise durchzuführen, wenn sich das Erzeugnis im Fluss befindet (dynamische Probenahme).

Die Probenahme hat je Laderaum (physisch abtrennbare Einheit) zu erfolgen. Die Laderäume werden allerdings nacheinander geleert, sodass die ursprüngliche physische Trennung nach der Weiterbeförderung in die Lagereinrichtungen nicht mehr besteht. Die Probenahme kann daher unter Bezug auf die ursprüngliche physische Trennung oder auf die Trennung nach der Beförderung in die Lagereinrichtungen erfolgen.

Das Löschen einer Schiffsladung kann mehrere Tage in Anspruch nehmen. In der Regel muss die Beprobung in regelmäßigen Abständen während der gesamten Dauer des Löschvorgangs erfolgen. Es ist jedoch nicht immer praktikabel oder sinnvoll, dass sich ein amtlicher Inspektor während des gesamten Löschvorgangs für die Probenahme vor Ort aufhält. Daher ist die Beprobung eines Teils (einer Teilpartie) der gesamten Partie zulässig Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt.

Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

Auch wenn die amtliche Probe automatisch entnommen wird, muss ein Inspektor anwesend sein. Erfolgt die automatische Probenahme jedoch anhand voreingestellter Parameter, die während der Probenahme nicht verändert werden können, und werden die Einzelproben in einem verplombten Behälter gesammelt, was einen möglichen Betrug ausschließt, so ist die Anwesenheit eines Inspektors nur zu Beginn der Probenahme, bei jedem Wechsel des Probenbehälters und am Ende der Probenahme erforderlich.

8.2.2. Beprobung von Partien, die per Schiff befördert werden, durch statische Probenahme

Bei einer statischen Probenahme ist dasselbe Verfahren anzuwenden wie bei Lagereinrichtungen (Silos), die von oben zugänglich sind (siehe Nummer 8.4.1).

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie/des Laderaums erfolgen (von oben). Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.3. Beprobung großer Partien in Lagern

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie erfolgen. Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.4. Beprobung von Lagereinrichtungen (Silos)

8.4.1. Beprobung von Silos mit (leichtem) Zugang von oben

Die Probenahme muss am zugänglichen Teil der Partie erfolgen. Die Anzahl der Einzelproben wird unter Berücksichtigung des Umfangs der Teilpartie festgelegt. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.4.2. Beprobung von Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos)

8.4.2.1. Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos) mit einer Größe über 100 Tonnen

In solchen Silos gelagerte Futtermittel können nicht statisch beprobt werden. Wenn das im Silo gelagerte Futtermittel beprobt werden muss und keine Möglichkeit besteht, die Sendung zu bewegen, ist eine Vereinbarung mit dem Unternehmer dahin gehend zu treffen, dass dieser den Inspektor darüber informiert, wann das Silo geleert wird, damit eine Probenahme erfolgen kann, wenn sich das Futtermittel im Fluss befindet.

8.4.2.2. Silos ohne Zugang von oben (geschlossene Silos) mit einer Größe unter 100 Tonnen

Im Rahmen des Probenahmeverfahrens ist eine Menge von 50 bis 100 kg in einen Behälter abzufüllen und anschließend zu beproben. Die Größe der Sammelprobe entspricht der gesamten Partie, und die Anzahl der Einzelproben muss im Verhältnis zu der Menge stehen, die zur Probenahme aus dem Silo in einen Behälter abgefüllt wird. Wird ein Teil einer Futtermittelpartie derselben Gruppe oder Bezeichnung beprobt und erfüllt diese Teilpartie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so muss davon ausgegangen werden, dass das Ergebnis der Beprobung für die gesamte Futtermittelpartie gilt, es sei denn, eine eingehende Bewertung erbringt keinen Nachweis darüber, dass die restliche Partie den EU-Anforderungen nicht genügt.

8.5. Beprobung loser Futtermittel in großen geschlossenen Containern

Solche Partien können häufig erst nach dem Entladen beprobt werden. In bestimmten Fällen ist das Entladen am Einfuhrort oder am Kontrollpunkt nicht möglich, weshalb die Probenahme erfolgen sollte, wenn die betreffenden Container entladen sind.

9. Anweisungen für die Entnahme, Vorbereitung und Verpackung der Proben

9.1. Allgemeines

Die Proben müssen so schnell wie möglich entnommen und vorbereitet werden, wobei die nötigen Vorkehrungen zu treffen sind, um sicherzustellen, dass das Erzeugnis weder verändert noch verunreinigt wird. Die für die Probenahme bestimmten Geräte, Flächen und Behälter müssen sauber und trocken sein.

9.2. Einzelproben

Die Einzelproben sind nach dem Zufallsprinzip und unter gleichmäßiger Verteilung aus der gesamten Teilpartie zu entnehmen. Ihre Größe muss ungefähr gleich sein.

Die Größe der Einzelprobe muss mindestens 100 g bzw. 25 g bei Raufutter/Grünfutter mit geringer spezifischer Dichte betragen.

Sind nach dem Probenahmeverfahren gemäß Nummer 8 weniger als 40 Einzelproben zu entnehmen, muss die Größe der Einzelprobe im Verhältnis zur erforderlichen Größe der Sammelprobe festgelegt werden (siehe Nummer 6).

Bei der Beprobung kleiner Partien verpackter Futtermittel, bei der entsprechend den quantitativen Anforderungen eine begrenzte Anzahl von Einzelproben zu entnehmen ist, umfasst eine Einzelprobe den Inhalt einer Originaleinheit, der 1 kg bzw. 1 Liter nicht überschreitet.

Bei der Beprobung verpackter Futtermittel, die aus kleinen Einheiten bestehen (z.B. < 250 g) ist die Größe der Einzelprobe von der Größe der Einheit abhängig.

Bei Proben aus dem Fernabsatz hängt der Umfang der Einzelprobe von der Größe der Einheit ab und kann im Einzelfall auch weniger als 100 g oder 100 ml enthalten.

9.2.1. Lose Futtermittel

Die Probenahme kann gegebenenfalls auch bei einer Teilpartie erfolgen, die sich in Bewegung (Einladen oder Entladen) befindet.

9.2.2. Verpackte Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Nummer 5 wird aus jeder dieser Einheiten ein Teil des Inhalts mit einem Probenahmestab oder einer Schaufel entnommen. Gegebenenfalls sind die Proben zu entnehmen, nachdem die Einheiten getrennt entleert worden sind.

9.2.3. Homogene oder homogenisierbare flüssige oder halbflüssige Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Nummer 5 wird der Inhalt falls nötig homogenisiert und aus jeder Einheit eine Menge entnommen.

Die Einzelproben können auch beim Ablassen des Inhalts entnommen werden.

9.2.4. Nicht homogenisierbare flüssige oder halbflüssige Futtermittel

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Einheiten gemäß Nummer 5 werden in unterschiedlicher Höhe Proben entnommen.

Die Probenahme kann auch beim Ablassen des Inhalts erfolgen, wobei jedoch die ersten Fraktionen zu verwerfen sind.

In beiden Fällen muss das Gesamtvolumen mindestens 10 l betragen.

9.2.5. Futterblöcke und Lecksteine

Nach Auswahl der erforderlichen Anzahl der zu beprobenden Blöcke oder Steine gemäß Nummer 5 kann jedem Block oder Stein ein Teil entnommen werden. Besteht die Vermutung, dass es sich um einen nicht homogenen Block bzw. Stein handelt, so kann der ganze Block bzw. Stein als Probe genommen werden.

Bei Futterblöcken oder Lecksteinen mit einem Gewicht von jeweils maximal 1 kg gilt der Inhalt eines Futterblocks oder Lecksteins als Einzelprobe.

9.3. Vorbereitung der Sammelproben

Die Einzelproben werden gemischt und zu einer einzigen Sammelprobe zusammengestellt.

9.4. Vorbereitung der Endproben

Das Material in der Sammelprobe ist sorgfältig zu mischen. ²

Jede Probe wird in einen geeigneten Container/Behälter gefüllt. Es sind alle notwendigen Vorkehrungen zu treffen, damit jede Veränderung der Zusammensetzung bzw. jede Verunreinigung oder Verfälschung der Probe während des Transports oder der Lagerung vermieden wird.

9.4.1. Stoffe mit gleichmäßiger Verteilung

Bei der Untersuchung auf Bestandteile oder Stoffe, die im Futtermittel gleichmäßig verteilt sind, kann die Sammelprobe repräsentativ auf mindestens 2,0 kg bzw. 2,0 l reduziert werden (reduzierte Probe) ³, vorzugsweise mithilfe eines mechanischen oder automatischen Probenteilers. Bei der Beprobung von Hülsenfrüchten, Getreidekörnern und Schalenfrüchten auf Pflanzenschutzmittelrückstände beträgt die Mindestgröße der reduzierten Probe 3 kg. Falls aufgrund der Art des Futtermittels die Verwendung eines Probenteilers nicht möglich oder ein Probenteiler nicht verfügbar ist, kann die Probe nach dem Vierteilungsverfahren reduziert werden.

Dann werden aus der Sammelprobe oder den reduzierten Proben ungefähr gleich große Endproben (für Kontroll-, Verteidigungs- und etwaige Referenzzwecke) entsprechend den quantitativen Anforderungen in Nummer 7 genommen.

9.4.2. Stoffe mit ungleichmäßiger Verteilung

Bei der Untersuchung auf Bestandteile, einschließlich genetisch veränderter Ausgangserzeugnisse, oder auf Stoffe, die ungleichmäßig im Futtermittel verteilt sein können, muss die Sammelprobe folgende Anforderungen erfüllen:

1. Sie wird vollständig homogenisiert. Danach werden aus der homogenisierten Sammelprobe ungefähr gleich große Endproben (für Kontroll-, Verteidigungs- und etwaige Referenzzwecke) entsprechend den quantitativen Anforderungen in Nummer 7 genommen; oder
2. sie wird mithilfe eines mechanischen oder automatischen Probenteilers auf mindestens 2 kg bzw. 2 l reduziert. ⁴ Nur dann, wenn aufgrund der Art des Futtermittels die Verwendung eines Probenteilers nicht möglich ist, kann die Probe falls nötig nach dem Vierteilungsverfahren reduziert werden. Für die Untersuchung auf genetisch veränderte Ausgangserzeugnisse im Rahmen der Verordnung (EU) Nr. 619/2011 muss die reduzierte Probe mindestens 35.000 Samen/Körner enthalten, damit die Endproben für Durchsetzungs-, Verteidigungs- und etwaige Referenzzwecke im Umfang von mindestens 10.000 Samen/Körnern gewonnen werden können (siehe Fußnote ** in Nummer 6 und Fußnote * in Nummer 7).

Dann werden aus den reduzierten Proben ungefähr gleich große Endproben entsprechend den quantitativen Anforderungen in Nummer 7 genommen.

9.5. Verpackung der Proben

Die Behälter oder Packungen sind so zu verplomben und zu kennzeichnen, dass sie nicht ohne Beschädigung der Plombe geöffnet werden können. Hierbei muss die gesamte Kennzeichnung von der Plombe erfasst werden. Alternativ kann die Probe in einen Behälter verfüllt werden, der so verschließbar ist, dass er nicht geöffnet werden kann, ohne das Gefäß bzw. den Behälter dabei irreversibel zu beschädigen. Eine mehrmalige Verwendung des Gefäßes bzw. Behälters ist zu vermeiden.

9.6. Versendung der Proben an das Labor

Die Probe ist - zusammen mit den untersuchungsrelevanten Angaben - so schnell wie möglich an das benannte Analyselabor zu versenden.

10. Probenahmeprotokoll

Für jede Probe ist ein Probenahmeprotokoll zu erstellen, aus dem die Identität und der Umfang der Teilpartie eindeutig hervorgehen.

Im Protokoll wird außerdem jede Abweichung von den in dieser Verordnung festgelegten Probenahmeverfahren vermerkt.

Das Protokoll wird dem amtlichen Kontrolllabor sowie dem Futtermittelunternehmer und/oder dem vom Futtermittelunternehmer benannten Labor zur Verfügung gestellt.

11. Probe aus dem Fernabsatz

• Um eine Probe aus dem Fernabsatz zu erhalten, fordert die zuständige Behörde über Fernkommunikationstechniken das Futtermittel vom Futtermittelunternehmer an. In diesem Fall muss die zuständige Behörde, wenn sie Futtermittel anfordert, ihre offizielle Identität gegenüber dem Futtermittelunternehmer nicht offenlegen und kann eine Deckidentität verwenden.
• Die Sammelprobe und die Endproben der Probe aus dem Fernabsatz sind unmittelbar nach Eingang der Sendung durch hierzu befugte Personen zu entnehmen. Zur Gewinnung der Sammelprobe muss eine angemessene Anzahl von Einzelproben nach dem Zufallsprinzip und unter gleichmäßiger Verteilung aus der erhaltenen Gesamtmenge entnommen und sorgfältig gemischt/homogenisiert werden - und zwar so weit wie möglich im Einklang mit den Grundsätzen der Nummer 5 sowie der Nummern 9.2 und 9.3. Ist das Futtermittel in Einzeleinheiten abgepackt, sollten mindestens 4 Einheiten angefordert werden, aus denen mindestens eine Einzelprobe zu entnehmen ist. Sollte sich im Einzelfall erweisen, dass die erhaltenen Einheiten aus verschiedenen Partien stammen, so ist die Zahl der zu beprobenden Einheiten zu verringern und auf jene Einheiten zu beschränken, die aus derselben Partie stammen. Bei der Untersuchung der Probe aus dem Fernabsatz auf Bestandteile oder Stoffe, die ungleich im Futtermittel verteilt sind, muss die Anzahl der Einzelproben mindestens 2,5-mal höher sein als bei Proben, die auf Stoffe untersucht werden, die gleichmäßig im Futtermittel verteilt sind.

  Aus der Sammelprobe werden dann die entsprechenden Endproben (für Durchsetzungs-, Verteidigungs- und etwaige Referenzzwecke) nach Möglichkeit entsprechend den Grundsätzen nach Nummer 9.4 entnommen, und aus dem Probenahmeprotokoll geht hervor, dass es sich bei der Probe um eine Probe aus dem Fernabsatz handelt. Die zuständige Behörde informiert danach den Futtermittelunternehmer unverzüglich über die Probenahme. Dem Futtermittelunternehmer wird ferner mitgeteilt, dass eine Probe nach Möglichkeit von der zuständigen Behörde für ihn an einem bestimmten Ort zu Verteidigungszwecken zur Verfügung gehalten oder an den Futtermittelunternehmer selbst oder an das vom Futtermittelunternehmer gemäß den geltenden nationalen Vorschriften benannte Labor geschickt wird.

  Wird die Probe direkt an das amtliche Labor geschickt, so muss die Endprobe im Labor von dazu ermächtigten Personen oder im Beisein von hierzu ermächtigten Personen vorbereitet und versiegelt werden. Das Probenahmeprotokoll der Probe aus dem Fernabsatz ist unmittelbar nach der Erstellung der Endproben an die zuständige Behörde zu schicken, die den Futtermittelunternehmer über die Probenahme informiert.

  Die Menge, die der Futtermittelunternehmer an die zuständige Behörde ausgeliefert hat, gilt als ein Teil einer Partie Futtermittel der gleichen Gruppe oder Bezeichnung. Erfüllt dieser Teil einer Partie nachweislich nicht die EU-Anforderungen, so ist gemäß Artikel 15 der Verordnung (EG) Nr. 178/2002 des Europäischen Parlaments und des Rates ⁵ auch im Fall einer Probe aus dem Fernabsatz davon auszugehen, dass sämtliche Futtermittel in dieser Partie gleichermaßen betroffen sind, es sei denn, bei einer eingehenden Prüfung (gegebenenfalls bei einer Kontrolle vor Ort) wird kein Nachweis dafür gefunden, dass der Rest der Partie die EU-Anforderungen nicht erfüllt.

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A. Vorbereitung der Proben zur Analyse

1. Zweck

Die in diesem Anhang beschriebenen Verfahren betreffen die Vorbereitung der zur Analyse bestimmten Proben, die nach der Probenahme gemäß den Bestimmungen in Anhang I an die Kontrolllabors versandt wurden.

Die Vorbereitung der Laborproben muss so erfolgen, dass die in den Analysemethoden vorgesehenen Einwaagen homogen und repräsentativ für die Endproben sind.

Über die in diesem Anhang beschriebenen Verfahren hinaus ist auch der Leitfaden für die Probenvorbereitung gemäß EN ISO 6498 zu befolgen.

2. Vorsichtsmaßnahmen

Die Wahl des Verfahrens für die Probenvorbereitung hängt von der Art der anzuwendenden Analysemethode und den zu untersuchenden Bestandteilen oder Stoffen ab. Daher ist es äußerst wichtig, dass das angewandte Probenvorbereitungsverfahren für die jeweilige Analysemethode und für die zu untersuchenden Bestandteile oder Stoffe geeignet ist.

Alle notwendigen Schritte sind so durchzuführen, dass eine Verunreinigung der Probe und eine Veränderung ihrer Zusammensetzung weitestmöglich vermieden werden.

Das Zermahlen, Mischen und Sieben muss unverzüglich erfolgen, wobei die Probe möglichst wenig Luft und Licht ausgesetzt werden darf. Die Verwendung von Mühlen oder Zerkleinerungsgeräten, die zu einer merklichen Erwärmung der Probe führen könnten, ist nicht zulässig.

Für besonders hitzeempfindliche Futtermittel wird manuelles Mahlen empfohlen. Es ist außerdem darauf zu achten, dass die verwendeten Geräte keine Kontaminationsquelle bilden.

Die Homogenisierung der Probe durch Aufschlämmen mittels Hochschermischen mit Wasser ergibt erwiesenermaßen in bestimmten Fällen homogenere Teilproben als eine trockene Homogenisierung/Trockenmahlen, insbesondere bei heterogen verteilten chemischen Stoffen. Allerdings kann auch eine Homogenisierung durch ausreichendes Trockenmahlen homogene Teilproben ergeben.

In bestimmten Fällen, z.B. bei der Bestimmung von Mutterkorn, schädlichen botanischen Verunreinigungen usw., darf die Homogenisierung der Probe nicht durch Mahlen, sondern durch ausreichendes Durchmischen der Probe erfolgen.

Kann die Probe nicht ohne eine signifikante Veränderung ihres Feuchtigkeitsgehalts vorbereitet werden, so ist dieser vor und nach der Vorbereitung gemäß der in Anhang III Teil A festgelegten Methode zu bestimmen.

3. Verfahren

3.1 Allgemeines Verfahren

Das Testaliquot ist der homogenisierten Endprobe zu entnehmen. Das Kegeln und das Vierteilungsverfahren werden nicht empfohlen, da dies mit einer hohen Teilungsfehlerquote bei den Testaliquoten einhergehen kann.

3.1.1. Futtermittel, die direkt gemahlen werden können

• Die Endprobe wird gemischt und in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, muss die Probe unmittelbar vor der Einwaage (Testaliquot) erneut gemischt werden.

3.1.2. Futtermittel, die nach Trocknung gemahlen werden können

• Sofern in der Analysemethode nicht anders festgelegt, wird die Endprobe nach dem in Nummer 4.3 der Methode zur Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts (siehe Anhang III Teil A) vorgesehenen Vortrocknungsverfahren bis auf einen Feuchtigkeitsgehalt von 8-12 % getrocknet. Die weitere Vorbereitung erfolgt gemäß Nummer 3.1.1.

3.1.3. Flüssige oder halbflüssige Futtermittel

• Die Endprobe wird in einen geeigneten sauberen, trockenen, luftdicht verschließbaren Behälter abgefüllt. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, muss die Probe unmittelbar vor der Einwaage (Testaliquot) gründlich gemischt werden.

3.1.4. Andere Futtermittel

• Endproben, die nach keinem der oben genannten Verfahren vorbereitet werden können, sind nach einem anderen Verfahren zu behandeln, das gewährleistet, dass die Einwaagen (Testaliquote) homogen und repräsentativ für die Endproben sind.

3.2. Besonderes Verfahren bei Sichtprüfungen oder mikroskopischen Untersuchungen oder im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe

• Bei einer Sichtprüfung (ohne Zuhilfenahme eines Mikroskops) wird die vollständige Sammel- oder Endprobe untersucht.
• Bei einer mikroskopischen Untersuchung kann das Labor die Sammelprobe reduzieren bzw. die reduzierte Probe noch weiter reduzieren. Die Endproben für die Gegenprobe und für etwaige Referenzzwecke werden nach einem Verfahren entnommen, das dem Verfahren zur Herstellung der Endprobe für den Vollzug gleichwertig ist.
• Im Fall einer Homogenisierung der vollständigen Sammelprobe werden die Endproben aus der homogenisierten Sammelprobe entnommen.
• Zur Bestimmung von Mutterkorn und schädlichen botanischen Verunreinigungen muss die Endprobe in zwei gleich schwere Teilproben von etwa 500 g aufgeteilt werden. Eine Teilprobe ist zu untersuchen. Ist das Ergebnis der Teilproben gleich oder kleiner 50 % (analytische Schwelle) des Höchstgehalts (Maximum Level - ML), ist der Höchstgehalt in der Probe eingehalten. Liegt das Ergebnis bei über 50 % des Höchstgehalts, muss eine weitere Teilprobe untersucht werden; anschließend wird der Durchschnitt der Ergebnisse beider Teilproben herangezogen, um die Einhaltung des Höchstgehalts zu überprüfen.

4. Lagerung der Proben

Die Proben müssen bei einer Temperatur gelagert werden, die ihre Zusammensetzung nicht beeinflusst. Proben, die zur Analyse von Vitaminen oder besonders lichtempfindlichen Stoffen bestimmt sind, sind so zu lagern, dass die Probe nicht durch Licht beeinträchtigt wird.

B. Bestimmungen über in Analyseverfahren verwendete Reagenzien und Geräte

1. Sofern in den Analysemethoden nicht anders festgelegt, müssen alle zur Analyse verwendeten Reagenzien von analysenreiner (p. a.) Qualität sein. Bei der Analyse von Spurenelementen muss die Reinheit der Reagenzien durch Mitführen von Blindproben überprüft werden. Je nach den ermittelten Werten kann eine weitere Reinigung der Reagenzien erforderlich sein.
2. Bei jedem in den Analysemethoden genannten Lösungs-, Verdünnungs-, Spül- oder Auswaschvorgang, bei dem keine Angabe über die Art des zu verwendenden Lösungs- oder Verdünnungsmittels gemacht wird, ist Wasser zu verwenden. Im Allgemeinen wird demineralisiertes oder destilliertes Wasser verwendet. In besonderen Fällen, die in den Analysemethoden angegeben werden, ist das Wasser speziellen Reinigungsverfahren zu unterziehen.
3. Da die übliche Ausstattung von Kontrolllabors vorausgesetzt wird, werden nur besondere Instrumente und Geräte oder solche, die eine spezifische Verwendung erfordern, in den Analysemethoden aufgeführt. Sie müssen gut gereinigt sein, vor allem bei der Bestimmung sehr geringer Stoffmengen.

C. Anwendung von Analysemethoden und Formulierung der Ergebnisse

1. Extraktionsverfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Extraktionsverfahren vor. Generell können andere Extraktionsverfahren als das in der Methode genannte Verfahren angewandt werden, und zwar unter der Bedingung, dass das angewandte Extraktionsverfahren für die analysierte Matrix eine vergleichbare Extraktionseffizienz aufweist wie das in der Methode genannte Verfahren.

2. Clean-up-Verfahren

Einige Methoden geben ein spezifisches Clean-up-Verfahren vor. Generell können andere Clean-up-Verfahren als das in der Methode genannte Verfahren angewandt werden, und zwar unter der Bedingung, dass das angewandte Clean-up-Verfahren für die analysierte Matrix zu vergleichbaren Analyseergebnissen führt wie das in der Methode genannte Verfahren.

3. Anzahl der Bestimmungen

Bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe sind - sofern das Ergebnis der ersten Bestimmung deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert liegt - keine weiteren Bestimmungen erforderlich, vorausgesetzt, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In anderen Fällen ist eine Zweitanalyse (Zweitbestimmung) erforderlich, um eine interne Kreuzkontamination oder ein versehentliches Vertauschen der Proben auszuschließen. Für die weitere Bewertung wird der Mittelwert der beiden Bestimmungen herangezogen.

Bei der Kontrolle des Mindest- oder Höchstgehalts an Futtermittelzusatzstoffen sind - sofern das Ergebnis der Erstbestimmung über dem Mindestgehalt bzw. unter dem Höchstgehalt liegt - keine weiteren Bestimmungen erforderlich, vorausgesetzt, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In anderen Fällen ist eine Zweitanalyse (Zweitbestimmung) erforderlich, um eine interne Kreuzkontamination oder ein versehentliches Vertauschen der Proben auszuschließen. Für die weitere Bewertung wird der Mittelwert der beiden Bestimmungen herangezogen.

Bei der Kontrolle des angegebenen Gehalts an einem Stoff oder einer Zutat sind - sofern das Ergebnis der Erstbestimmung den angegebenen Gehalt bestätigt, d. h., wenn das Analyseergebnis innerhalb des akzeptablen Toleranzbereichs für den angegebenen Gehalt liegt - keine weiteren Bestimmungen erforderlich, vorausgesetzt, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden. In anderen Fällen ist eine Zweitanalyse (Zweitbestimmung) erforderlich, um eine interne Kreuzkontamination oder ein versehentliches Vertauschen der Proben auszuschließen. Der Mittelwert der beiden Bestimmungen wird für die weitere Bewertung herangezogen (das durchschnittliche Analyseergebnis liegt innerhalb des akzeptablen Toleranzbereichs für den angegebenen Gehalt oder nicht).

In einigen Fällen ist der akzeptable Toleranzbereich in Rechtsvorschriften definiert, beispielsweise in der Verordnung (EG) Nr. 767/2009 und der Verordnung (EU) 2019/4 des Europäischen Parlaments und des Rates ¹.

4. Berichterstattung über die angewandte Analysemethode

Im Analysebericht ist anzugeben, welche Analysemethode angewandt wurde.

5. Bericht über die Analyseergebnisse

Das Ergebnis ist gemäß den Anweisungen in der Analysemethode mit einer angemessenen Zahl an signifikanten Ziffern anzugeben und, falls nötig, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Endprobe vor deren Vorbereitung umzurechnen.

Die meisten in den EU-Rechtsvorschriften für Futtermittel definierten Gehalte (z.B. Höchstgehalt, Mindestgehalt) wurden in Bezug auf Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 12 % festgelegt. Um das in der Probe gemessene Analyseergebnis gemäß dem vorgeschriebenen Gehalt bewerten zu können, muss das Analyseergebnis in diesen Fällen zunächst durch den Trockenmassegehalt der Probe (in %), multipliziert mit 88, dividiert werden, wie in der folgenden Formel angegeben:

Dabei gilt:

Wenn darüber hinaus die folgenden Bedingungen erfüllt sind:

• das Ergebnis der Analyse liegt signifikant (> 50 %) über oder unter den zu kontrollierenden Angaben/dem zu kontrollierenden Sollwert in der Kennzeichnung (je nachdem, ob es sich bei den Informationen/dem Sollwert in der Kennzeichnung um einen Höchst- oder Mindestgehalt handelt);
• der Feuchtigkeitsgehalt des beprobten Futtermittels ist bekannt und es kann bestimmt werden, dass die Berichtigung um den Feuchtigkeitsgehalt die Bewertung nicht ändert;
  dann kann die Berichtigung um den Feuchtigkeitsgehalt - sofern sie nicht für die Interpretation erforderlich ist - entfallen (z.B. in Fällen, in denen es keinen Sollwert oder vorgeschriebenen Gehalt gibt), unter der Voraussetzung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient.

Wird das Analyseergebnis um den Feuchtigkeitsgehalt korrigiert, muss die entsprechende Messunsicherheit im gleichen Verfahren ebenfalls korrigiert werden.

Bei der Bestimmung von Mutterkorn oder schädlichen botanischen Verunreinigungen durch Sichtprüfung oder mikroskopischen Untersuchung ist eine Berichtigung um den Feuchtigkeitsgehalt nicht erforderlich.

6. Analysemessunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse auf unerwünschte Stoffe

Hinsichtlich unerwünschter Stoffe im Sinne der Richtlinie 2002/32/EG erfüllt ein zur Verfütterung bestimmtes Erzeugnis die Bestimmung bezüglich des festgelegten Höchstgehalts nicht, wenn das aus einem Mittelwert aus zwei unabhängigen Bestimmungen bestehende Analyseergebnis, bezogen auf ein Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 12 %, unter Berücksichtigung der erweiterten Analysemessunsicherheit bei Anwendung eines Erweiterungsfaktors von 2, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt, und bei Berichtigung um die Wiederfindungsrate den Höchstgehalt überschreitet. Dies bedeutet, dass zur Beurteilung der Einhaltung der Höchstgehalte die gemessene Konzentration - nach Berichtigung um die Wiederfindungsrate und nach Abzug der erweiterten Analysemessunsicherheit - herangezogen wird. Dieses Verfahren wird nur dann angewandt, wenn die Analysemethode die Schätzung der erweiterten Analysemessunsicherheit und die Berichtigung um die Wiederfindungsrate ermöglicht (z.B. nicht erforderlich bei Sichtprüfung/mikroskopischer Untersuchung).

Überschreitet das Analyseergebnis der zu Verteidigungszwecken entnommenen Probe den Höchstgehalt (ohne Berücksichtigung der erweiterten Analysemessunsicherheit), bestätigt dies die anhand der Kontrollprobe festgestellte Nichteinhaltung, sofern keine spezifischen nationalen Vorschriften diesbezüglich bestehen.

Das Analyseergebnis ist wie folgt festzuhalten (soweit die angewandte Analysemethode die Schätzung der erweiterten Analysemessunsicherheit ermöglicht):

1. Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wenn dies angebracht und sinnvoll ist; falls berichtigt, muss dies angegeben werden. Die Wiederfindungsrate ist anzugeben, es sei denn, eine intrinsische Bias-Korrektur ist Teil des Verfahrens, wobei die Verzerrung die Differenz zwischen dem Messwert und der Referenzkonzentration ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn letztere 90-110 % beträgt;
2. als "x +/- U", wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Analysemessunsicherheit bezeichnet und ein Erweiterungsfaktor von 2 ² verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt.

Liegt jedoch das Analyseergebnis deutlich (> 50 %) unter dem zu kontrollierenden Sollwert - und unter der Bedingung, dass die geeigneten Qualitätsverfahren angewandt werden und die Analyse lediglich dem Zweck der Überprüfung der Einhaltung der Rechtsvorschriften dient -, können die Angabe der Wiederfindungsrate und der erweiterten Analysemessunsicherheit entfallen (etwa wenn kein Sollwert oder vorgeschriebener Gehalt besteht), sofern die Messunsicherheit nicht für die Interpretation erforderlich ist.

7. Analysemessunsicherheit und Wiederfindungsrate bei der Analyse des Gehalts an Futtermittelzusatzstoffen

Bei der Überprüfung der Einhaltung des zulässigen Mindest- und Höchstgehalts an Futtermittelzusatzstoffen gelten der festgelegte Mindest- und Höchstgehalt eines Futtermittelzusatzstoffs als nicht eingehalten, wenn das aus einem Mittelwert aus zwei unabhängigen Bestimmungen bestehende Analyseergebnis bezogen auf ein Futtermittel mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 12 %:

• den Höchstgehalt unter Berücksichtigung der erweiterten Analysemessunsicherheit und der Berichtigung um die Wiederfindungsrate überschreitet. Zur Beurteilung der Einhaltung der Höchstgehalte wird die gemessene Konzentration (d. h. der Mittelwert zweier Bestimmungen) - nach Berichtigung um die Wiederfindungsrate und nach Abzug der erweiterten Analysemessunsicherheit - herangezogen.
• den Mindestgehalt unter Berücksichtigung der erweiterten Analysemessunsicherheit und der Berichtigung um die Wiederfindungsrate unterschreitet. Zur Beurteilung der Einhaltung der Höchstgehalte wird die gemessene Konzentration (d. h. der Mittelwert zweier Bestimmungen) - nach Berichtigung um die Wiederfindungsrate und nach Addieren der erweiterten Analysemessunsicherheit - herangezogen.

Überschreitet das Analyseergebnis der zu Verteidigungszwecken entnommenen Probe den Höchstgehalt (ohne Berücksichtigung der erweiterten Analysemessunsicherheit), bestätigt dies die anhand der Kontrollprobe festgestellte Nichteinhaltung, sofern keine spezifischen nationalen Vorschriften diesbezüglich bestehen.

Das Analyseergebnis ist wie folgt festzuhalten (soweit die angewandte Analysemethode die Schätzung der erweiterten Analysemessunsicherheit ermöglicht):

1. Berichtigung um die Wiederfindungsrate, wenn dies angebracht und sinnvoll ist; falls berichtigt, muss dies angegeben werden. Die Wiederfindungsrate ist anzugeben, es sei denn, eine intrinsische Bias-Korrektur ist Teil des Verfahrens, wobei die Verzerrung die Differenz zwischen dem Messwert und der Referenzkonzentration ist. Eine Berichtigung um die Wiederfindungsrate ist nicht erforderlich, wenn letztere 90-110 % beträgt;
2. als "x +/- U", wobei x das Analyseergebnis und U die erweiterte Analysemessunsicherheit bezeichnet und ein Faktor von 2 ³ verwendet wird, der zu einem Konfidenzniveau von ca. 95 % führt. "

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A. Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Feuchtigkeitsgehalt von Futtermitteln bestimmen. Bei Futtermitteln, die flüchtige Stoffe wie z.B. organische Säuren enthalten, ist zu beachten, dass zusammen mit dem Feuchtigkeitsgehalt auch eine bedeutende Anzahl an flüchtigen Stoffen bestimmt wird.

Sie betrifft nicht die Untersuchung von Milcherzeugnissen als Futtermittel-Ausgangserzeugnisse und von Mischfuttermitteln, die überwiegend aus Milcherzeugnissen bestehen, die Untersuchung von tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen oder die Untersuchung von Ölsaaten und Ölfrüchten.

Die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts bei Ölsaaten muss nach dem Verfahren gemäß EN ISO 665 - Bestimmung des Feuchtegehaltes und des Gehaltes an flüchtigen Bestandteilen - erfolgen, wobei Sojabohnen vor der Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts zu zermahlen sind.

2. Prinzip

Die Probe wird unter definierten Bedingungen getrocknet, die von der Art des Futtermittels abhängen. Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt. Bei festen Futtermitteln mit einem hohen Feuchtigkeitsgehalt ist eine zusätzliche Vortrocknung erforderlich.

3. Geräte

3.1. Zerkleinerungsgerät aus einem Material, das keine Feuchtigkeit absorbiert, leicht zu reinigen ist, eine schnelle und gleichmäßige Zerkleinerung ermöglicht, ohne eine merkliche Erwärmung hervorzurufen, das so weit wie möglich den Kontakt mit der Außenluft verhindert und den unter Nummer 4.1.1 und 4.1.2 gestellten Anforderungen entspricht (z.B. Mikroschlagkreuzmühlen, Mikrozerkleinerer mit Wasserkühlung, zerlegbare Kegelmühlen, langsam laufende Kegelmühlen oder Zahnscheibenmühlen).

3.2. Analysenwaage, Genauigkeit 1 mg.

3.3. Trockene Gefäße aus korrosionsbeständigem Metall oder Glas, mit luftdicht schließenden Deckeln; die Nutzfläche muss eine Verteilung der Analysenprobe von ca. 0,3 g/cm² ermöglichen.

3.4. Elektrisch beheizter, temperaturgeregelter Trockenschrank (± 2 °C), der eine schnelle Regelung der Temperatur gewährleistet und eine gute Lüftung besitzt ¹.

3.5. Elektrisch beheizter regulierbarer Vakuumtrockenschrank mit einer Ölpumpe, der entweder mit einer Vorrichtung für die Zufuhr warmer und getrockneter Luft oder mit einem Trocknungsmittel (z.B. Calciumoxid) ausgestattet ist.

3.6. Exsikkator mit dicker, perforierter Platte aus Metall oder Porzellan, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

4. Verfahren

4.1. Vorbereitung

4.1.1. Futtermittel, außer den unter Nummer 4.1.2 und 4.1.3 genannten

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen und erforderlichenfalls unter Vermeidung von Feuchtigkeitsänderungen entsprechend zerkleinert oder geteilt (siehe Nummer 6).

4.1.2. Getreide und Grütze

Mindestens 50 g der Probe werden entnommen Diese Menge wird so zermahlen, dass zumindest 50 % der Teilchen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm passiert werden können und dass beim Passieren durch ein Rundlochsieb mit einem Lochdurchmesser von 1 mm ein Rückstand von höchstens 10 % verbleibt.

4.1.3. Flüssige oder breiige Futtermittel; Futtermittel, die überwiegend aus Ölen und Fetten bestehen

Etwa 25 g der Probe, auf 10 mg genau gewogen, werden entnommen, mit einer entsprechenden, auf 10 mg genau gewogenen Menge wasserfreiem Sand vermischt, bis ein homogenes Produkt entsteht.

4.2. Trocknung

Ein Gefäß (Nummer 3.3) wird mit seinem Deckel im auf 103 °C eingestellten Trockenschrank 30 min ± 1 min lang getrocknet. Es wird aus dem Trockenschrank genommen und im Exsikkator (Nummer 3.6) auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen.

4.2.1. Futtermittel, außer den unter Nummer 4.2.2 und 4.2.3 genannten

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 1 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 103 °C vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 4 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 103 °C erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

Bei Futtermitteln, die überwiegend (> 50 %) aus Ölen und Fetten tierischen und pflanzlichen Ursprungs bestehen, wird eine zusätzliche Trocknung von 30 min im Trockenschrank bei 103 °C vorgenommen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.2.2. Getreide, Mehl, Grütze und Grieß

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der zerkleinerten Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 130 °C vorgeheizten Trockenschrank gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen. Es wird 2 h lang getrocknet, wobei die Trocknungszeit von dem Zeitpunkt an gerechnet wird, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 130 °C erreicht hat. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen.

4.2.3. Mischfuttermittel mit einem Saccharose- oder Lactosegehalt von mehr als 4 %: Futtermittel-Ausgangserzeugnisse wie z.B. Johannisbrotschrot, hydrolysierte Getreideerzeugnisse, Malzkeime, Zuckerrübenschnitzel, Fisch- und Zuckerpresssäfte

Das Gefäß wird mit seinem Deckel auf 0,5 mg genau gewogen. Etwa 5 g der Probe werden auf 1 mg genau in das tarierte Gefäß eingewogen und gleichmäßig verteilt. Das Gefäß wird ohne Deckel in den auf 80 bis 85 °C vorgeheizten Vakuumtrockenschrank (Nummer 3.5) gestellt. Damit die Temperatur des Trockenschranks nicht zu stark abfällt, ist das Gefäß möglichst rasch hineinzustellen.

Der Druck wird auf 100 Torr eingestellt. Die Probe wird 4 h lang bei diesem Druck entweder unter Zufuhr von heißer trockener Luft oder mittels eines Trocknungsmittels (etwa 300 g für 20 Proben) getrocknet. Im letzteren Fall wird beim Erreichen des vorgeschriebenen Drucks die Verbindung zur Vakuumpumpe unterbrochen. Die Trocknungszeit wird von dem Zeitpunkt an gerechnet, an dem die Temperatur im Trockenschrank erneut 80 bis 85 °C erreicht hat. Nach Ablauf der Trocknungszeit wird der Trockenschrank vorsichtig wieder auf atmosphärischen Druck gebracht. Nach Öffnen des Trockenschranks wird das Gefäß sofort wieder mit dem Deckel verschlossen, aus dem Schrank genommen, zum Abkühlen 30 bis 45 min lang in den Exsikkator (Nummer 3.6) gestellt und anschließend auf 1 mg genau gewogen. Es wird im Vakuumtrockenschrank weitere 30 min bei 80 bis 85 °C getrocknet und erneut gewogen. Der Unterschied zwischen den beiden Wägeergebnissen darf höchstens 0,1 % Feuchtigkeit betragen.

4.3. Vortrocknung (Teiltrocknung)

"Nasse" Futtermittel mit einem Massenanteil von weniger als 85 % Trockenmasse (z.B. Grünfutter, Gesamtmischrationen, (nicht)flüssige Futtermittel) müssen vor dem Feinzermahlen teilgetrocknet werden, um ihre stabilen Stoffe untersuchen zu können; bei instabilen Stoffen ist keine Teiltrocknung möglich.

Die Teiltrocknung kann entweder mithilfe eines Trockenschranks mit Luftumwälzung oder eines Mikrowellengeräts oder durch Gefriertrocknen erfolgen. Außer beim Teiltrocknen durch Gefriertrocknen geht es darum, das Futtermittel zu trocknen und gleichzeitig die Probentemperatur unter 60 °C zu halten, damit die chemische Zusammensetzung nur minimal beeinträchtigt wird. Eine Trocknung bei Temperaturen über 60 °C führt zu chemischen Veränderungen im Futter (z.B. Proteinabbau). Das getrocknete Futtermittel wird bei Raumtemperatur 15 min lang äquilibriert, anschließend wird die teilgetrocknete Masse gemessen, um eine potenzielle Veränderung des Feuchtigkeitsgehalts, die während des Zermahlens und der Lagerung auftreten kann, so gering wie möglich zu halten. Beim Trocknen bei Temperaturen unter 60 °C wird dem Futtermittel nicht das gesamte Wasser entzogen; daher lässt sich mithilfe der (ersten) Teiltrocknung nicht die Gesamttrockenmasse des Futtermittels bestimmen. Nach dem Trocknen wird die Teilprobe zermahlen und im Rahmen der Bestimmung der anderen chemischen Bestandteile auf die (endgültige) Trockenmasse der teilgetrockneten Probe untersucht (3-15 % Restfeuchte).

Daher wird zur Bestimmung der Trockenmasse ein zweistufiges Verfahren empfohlen. Zunächst wird der Gehalt der teilgetrockneten Masse bestimmt (bei weniger als 85 % Trockenmasse), dann wird der verbleibende Trockenmassegehalt anhand einer zermahlenen Analysenprobe bestimmt und die teilgetrocknete Masse wird mit der verbleibenden Trockenmasse multipliziert, um den Gesamttrockenmassegehalt zu bestimmen.

5. Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt (X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgenden Formeln berechnet:

5.1. Trocknung ohne Vortrocknung

wobei:

5.2. Trocknung mit Vortrocknung ²

wobei:

5.3. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,2 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten, außer bei Nassfutter für Heimtiere und Kauspielzeug für Hunde, wo die Differenz 0,5 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten darf.

6. Bemerkung

Wenn eine Zerkleinerung sich als notwendig erweist und dabei mit einer Änderung des Feuchtigkeitsgehalts des Materials gerechnet werden muss, so sind die Analyseergebnisse, die die Bestandteile des Futtermittels betreffen, auf den Feuchtigkeitsgehalt der Originalprobe umzurechnen.

B. Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt an Wasser und flüchtigen Stoffen in tierischen und pflanzlichen Fetten und Ölen bestimmen.

2. Prinzip

Die Probe wird bei 103 °C getrocknet, bis kein Gewichtsverlust mehr eintritt (der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen darf 1 mg nicht überschreiten). Der Gewichtsverlust wird durch Wiegen bestimmt.

3. Geräte

3.1. Schale mit flachem Boden, aus korrosionsbeständigem Material, Durchmesser: 8 bis 9 cm, Höhe ca. 3 cm.

3.2. Thermometer mit verstärkter Kugel und Ausdehnungsraum am oberen Ende, von ca. 80 bis mindestens 110 °C graduiert, Länge ca. 10 cm.

3.3. Sandbad oder elektrische Heizplatte.

3.4. Exsikkator, der ein wirksames Trocknungsmittel enthält.

3.5. Analysenwaage.

4. Verfahren

Etwa 20 g der homogenisierten Probe werden auf 1 mg genau in die trockene, gewogene Schale (Nummer 3.1.) eingewogen, die das Thermometer (Nummer 3.2) enthält, und auf dem Sandbad oder der elektrischen Heizplatte (Nummer 3.3) unter ständigem Rühren mit dem Thermometer so erhitzt, dass in ca. 7 min eine Temperatur von 90 °C erreicht wird

Entsprechend der Häufigkeit, mit der Gasblasen vom Boden der Schale aufsteigen, wird die Heizintensität verringert. Die Temperatur darf 105 °C nicht überschreiten. Unter ständigem Abkratzen des Bodens der Schale wird weiter umgerührt, bis sich keine Blasen mehr bilden.

Um sicherzustellen, dass keine Feuchtigkeit mehr vorhanden ist, wird mehrmals auf 103 °C ± 2 °C erhitzt und zwischen aufeinanderfolgenden Erhitzungen jeweils auf 93 °C gekühlt. Anschließend wird bis zur Raumtemperatur im Exsikkator (Nummer 3.4) abkühlen gelassen und gewogen. Dieses Verfahren ist so oft zu wiederholen, bis der Gewichtsverlust zwischen 2 aufeinanderfolgenden Wägungen 2 mg nicht mehr überschreitet.

5. Berechnung der Ergebnisse

Der Feuchtigkeitsgehalt ( X) der Probe als Prozentsatz wird nach folgender Formel berechnet:

X = (m₁- m₂) × 100/m

wobei:

Ergebnisse unter 0,05 % sollten mit der Bezeichnung "weniger als 0,05 %" angegeben werden.

Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 0,1 % Feuchtigkeit (absolut) nicht überschreiten.

C. Bestimmung des Stickstoffgehalts und Berechnung des Rohproteingehalts

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Rohproteingehalt von Futtermitteln anhand des nach Kjeldahl bestimmten Stickstoffgehalts ³ bestimmen.

2. Prinzip

Die Probe wird durch Schwefelsäure in Anwesenheit eines Katalysators aufgeschlossen. Der saure Aufschluss wird durch eine Natriumhydroxidlösung alkalisiert. Das Ammoniak wird durch Destillation abgetrennt und in einer definierten Menge Schwefelsäure aufgefangen, deren Überschuss durch eine Standard-Natriumhydroxidlösung titriert wird.

Alternativ wird das freigesetzte Ammoniak in überschüssiger Borsäurelösung destilliert, gefolgt von einer Titration mit Salz- oder Schwefelsäurelösung.

3. Reagenzien

3.1. Kaliumsulfat.

3.2. Katalysator: Kupfer(II)-oxid, CuO, oder Kupfer(II)-sulfatpentahydrat, CuSO4 5H2O.

3.3. Zinkgranulat.

3.4. Schwefelsäure, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,25 mol/l.

3.6. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,10 mol/l.

3.7. Schwefelsäure, volumetrische Standardlösung, c(H₂SO₄) = 0,05 mol/l.

3.8. Methylrot-Indikator: 300 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol (σ = 95 bis 96 %) gelöst.

3.9. Natriumhydroxidlösung (Verwendung technischer Qualität möglich), β = 40 g/100 ml (40 %).

3.10. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Natriumhydroxid, volumetrische Standardlösung, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Bimssteinkörner, mit Salzsäure gewaschen und geglüht.

3.13. Acetanilid (Schmelzpunkt = 114 °C, N-Gehalt = 10,36 %).

3.14. Saccharose (stickstofffrei).

3.15. Borsäure (H₃BO₃).

3.16. Methylrot-Indikatorlösung: 100 mg Methylrot werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.17. Bromkresolgrünlösung: 100 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml Ethanol oder Methanol gelöst.

3.18. Borsäurelösung (10 bis 40 g/l in Abhängigkeit vom eingesetzten Gerät)

Bei einer kolorimetrischen Endpunktbestimmung sind der Borsäurelösung Methylrot- und Bromkresolindikatoren zuzufügen. Wird 1 l Borsäurelösung zubereitet, sind vor dem Auffüllen zur Marke 7 ml Methylrot-Indikatorlösung (Nummer 3.16) und 10 ml Bromkresolgrünlösung (Nummer 3.17) zuzufügen.

In Abhängigkeit von dem verwendeten Wasser kann sich der pH-Wert von einer Borsäurelösung zur anderen unterscheiden. Der pH-Wert der Borsäurelösung muss zwischen 4,3 und 4,7 liegen. Häufig ist eine Einstellung des pH-Werts mithilfe einer geringen Menge Alkali erforderlich, um eine positive Blindprobe zu erhalten.

Anmerkung: Eine Zugabe von rund 3 ml bis 4 ml NaOH (Nummer 3.11) zu 1 l Borsäure von 10 g/l führt in der Regel zu guten Einstellungen. Die Lösung ist bei Raumtemperatur aufzubewahren und während der Aufbewahrung vor Lichteinfall und Ammoniakdämpfen zu schützen.

3.19. Salzsäure, volumetrische Standardlösung, c(HCl) = 0,10 mol/l.

4. Geräte

Für Aufschluss, Destillation und Titration nach dem Kjeldahl-Verfahren geeignete Geräte.

5. Verfahren

5.1. Aufschluss

Von der Probe wird 1 g auf 0,001 g genau gewogen und in den Kolben des Aufschlussgeräts gegeben. Anschließend werden 15 g Kaliumsulfat (Nummer 3.1), eine geeignete Katalysatormenge (Nummer 3.2) (0,3 bis 0,4 g Kupfer(II)-oxid oder 0,9 bis 1,2 g Kupfer(II)-sulfatpentahydrat), 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.4) und ggf. einige Bimssteinkörnchen (Nummer 3.12) zugesetzt und vermischt.

Der Kolben wird, wenn notwendig, unter regelmäßigem Schwenken zunächst mäßig erhitzt, bis die Substanz verkohlt ist und das Schäumen aufgehört hat. Dann wird die Flüssigkeit stärker erhitzt und gleichmäßig am Sieden gehalten. Bei korrekter Erhitzung kondensiert die siedende Säure auf der Kolbenwand. Ein Überhitzen der Kolbenwände und Ansetzen organischer Partikel ist zu vermeiden.

Sobald die Lösung klar ist und sich hellgrün färbt, wird sie noch weitere 2 h am Sieden gehalten und danach abkühlen gelassen.

5.2. Destillation

Es wird vorsichtig so viel Wasser zugegeben, dass die Sulfate vollständig gelöst werden. Nach dem Abkühlen werden ggf. einige Körner Zinkgranulat (Nummer 3.3) zugesetzt. Es wird entweder gemäß Nummer 5.2.1 oder 5.2.2 weiterverfahren.

5.2.1. Destillation von Schwefelsäure

In den Auffangkolben des Destillationsapparats werden je nach dem zu erwartenden Stickstoffgehalt genau 25 ml Schwefelsäure (Nummer 3.5 oder 3.7) gebracht und einige Tropfen Methylrot-Indikator (Nummer 3.8) hinzugefügt.

Der Aufschlusskolben wird mit dem Kühler des Destillationsapparats verbunden und das Ende des Kühlers mindestens 1 cm tief in die Flüssigkeit des Auffangkolbens gesenkt (siehe Bemerkung 8.3). Dann werden 100 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.9) langsam in den Aufschlusskolben eingefüllt, wobei kein Ammoniak entweichen darf (siehe Bemerkung 8.1). Der Kolben wird so lange erhitzt, bis alles Ammoniak überdestilliert ist.

5.2.2. Destillation von Borsäure

Wird der Ammoniakgehalt des Destillats von Hand titriert, findet das im Folgenden beschriebene Verfahren Anwendung. Bei einem voll automatisierten Destilliergerät, das auch die Titration des Ammoniakgehalts des Destillats vornimmt, ist die Betriebsanleitung des Herstellers zu befolgen.

Ein Auffangkolben mit 25 bis 30 ml Borsäurelösung (Nummer 3.18) wird so unter den Ablauf des Kühlers gestellt, dass sich das Ablaufrohr unter der Oberfläche der überschüssigen Borsäurelösung befindet. Das Destilliergerät wird so eingestellt, dass es 50 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.9) abgibt. Die Bedienung des Destilliergeräts erfolgt entsprechend den Anleitungen des Herstellers. Anschließend wird das durch die Zugabe der Natriumhydroxidlösung freigesetzte Ammoniak abdestilliert. Das Destillat wird in der Borsäure (Auffangsäure) aufgefangen. Die Destillatmenge (Dauer der Dampfdestillation) hängt von der in der Probe enthaltenen Menge Stickstoff ab. Hierbei sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

5.3. Titration

Es wird entweder gemäß Nummer 5.3.1 oder 5.3.2 weiterverfahren.

5.3.1. Schwefelsäure

Die überschüssige Schwefelsäure im Auffangkolben wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.10 oder 3.11) in Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Schwefelsäure titriert, bis der Endpunkt erreicht ist.

5.3.2. Borsäure

Der Inhalt des Auffangkolbens wird mit der volumetrischen Standardlösung der Salzsäure (Nummer 3.19) oder mit der volumetrischen Standardlösung der Schwefelsäure (Nummer 3.6) unter Verwendung einer Bürette titriert und es wird die Menge des eingesetzten Titrationsmittels abgelesen.

Bei der kolorimetrischen Endpunktbestimmung ist der Endpunkt erreicht, wenn sich der Inhalt erstmals pink verfärbt. Die Bürette ist auf 0,05 ml genau abzulesen. Eine beleuchtete Magnetrührplatte oder ein fotometrischer Detektor können bei der Visualisierung des Endpunkts hilfreich sein.

Dies kann automatisch erfolgen bei Verwendung eines Wasserdampfdestillators mit automatischer Titration.

Hinsichtlich des Betriebs des jeweiligen Destillators bzw. des Destillier-/Titriergeräts sind die Anleitungen des Herstellers zu befolgen.

Wird ein vollautomatisches Destilliergerät eingesetzt, kann die automatische Titration des Ammoniaks auch mittels Endpunktbestimmung unter Verwendung eines potenziometrischen pH-Systems durchgeführt werden.

In diesem Fall wird eine automatische Titriervorrichtung mit einem pH-Meter verwendet. Das pH-Meter ist nach dem üblichen Labor-pH-Kalibrierverfahren ordnungsgemäß im Bereich pH 4 bis pH 7 zu kalibrieren.

Der pH-Endpunkt der Titration ist bei einem pH-Wert von 4,6 erreicht, dem steilsten Punkt der Titrationskurve (Wendepunkt).

5.4. Blindversuch

Zur Bestätigung, dass die Reagenzien stickstofffrei sind, wird ein Blindversuch (Aufschluss, Destillation und Titration) mit 1 g Saccharose (Nummer 3.14) anstelle der Probe durchgeführt.

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Berechnungen werden gemäß Nummer 6.1 oder 6.2 durchgeführt.

6.1. Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.1

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

6.2. Berechnung für die Titration nach Nummer 5.3.2

6.2.1. Titration mit Salzsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

6.2.2. Titration mit Schwefelsäure

Der Rohproteingehalt, ausgedrückt als Massenanteil, wird nach folgender Formel berechnet:

wobei:

7. Beurteilung des Verfahrens

7.1. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• 0,4 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,
• 2,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,
• 0,8 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.2. Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• 1,8 % absolut bei Gehalten von weniger als 20 % Rohprotein,
• 9,0 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 20 bis 40 % Rohprotein,
• 3,6 % absolut bei Gehalten von mehr als 40 % Rohprotein.

7.3. Genauigkeit

Die Analyse (Aufschluss, Destillation und Titration) wird mit einer geeigneten Menge Acetanilid (Nummer 3.13) (z.B. 0,2 bis 0,3 g) in Gegenwart von 1 g Saccharose (Nummer 3.14) durchgeführt; 1 g Acetanilid verbraucht 14,80 ml Schwefelsäure (Nummer 3.5). Die Wiederfindung muss mindestens 99 % betragen.

8. Bemerkungen

8.1. Es können manuelle, halbautomatische oder automatische Geräte verwendet werden. Bei Geräten, die ein Umfüllen zwischen Aufschluss und Destillation erfordern, ist darauf zu achten, dass dies verlustlos geschieht. Verfügt der Destillationsapparat nicht über einen Tropftrichter, so erfolgt die Zugabe der Natriumhydroxidlösung unmittelbar vor dem Anschließen des Kolbens an den Kühler; die Flüssigkeit ist in diesem Fall langsam an den Kolbenwänden entlang laufen zu lassen.

8.2. Kommt es während des Aufschlusses zur Verfestigung der Mischung, ist mit der Bestimmung von vorn zu beginnen und eine größere als die unter Nummer 5.1 genannte Menge an Schwefelsäure (Nummer 3.4) zu verwenden.

8.3. Bei stickstoffarmen Proben kann die in den Auffangkolben einzufüllende Menge Schwefelsäure (Nummer 3.7) gegebenenfalls auf 10 oder 15 ml verringert und mit Wasser auf 25 ml aufgefüllt werden.

8.4. Für Routineanalysen können auch andere Methoden zur Bestimmung des Rohproteins herangezogen werden; die in diesem Teil C beschriebene Kjeldahl-Methode ist jedoch die Referenzmethode. Die Gleichwertigkeit der Ergebnisse der alternativen Methode (z.B. DUMAS) im Vergleich zur Referenzmethode muss für jede Matrix einzeln nachgewiesen werden. Da die mit einer alternativen Methode erzielten Ergebnisse auch nach Feststellung ihrer Gleichwertigkeit leicht von den mit der Referenzmethode erzielten Ergebnissen abweichen können, muss im Analysebericht angegeben werden, welche Analysemethode zur Bestimmung des Rohproteins angewendet wurde.

D. Bestimmung des Harnstoffgehalts

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt des als Futtermittelzusatzstoff in Futtermitteln für Wiederkäuer verwendeten Harnstoffs bestimmen.

2. Prinzip

Die Probe wird unter Zusatz eines Klärungsmittels in Wasser suspendiert. Die Suspension wird filtriert. Nach Zugabe von 4-Dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) wird der Gehalt an Harnstoff im Filtrat durch Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 420 nm bestimmt.

3. Reagenzien

3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydlösung: 1,6 g 4-DMAB werden in 100 ml 96%igen Ethanols gelöst und 10 ml Salzsäure (ρ₂₀ = 1,19 g/ml) werden hinzugefügt. Das Reagenz ist höchstens 2 Wochen haltbar.

3.2. Carrez-Lösung I: 21,9 g Zinkacetat, Zn (CH₃COO)₂·2H₂O, und 3 g Eisessig werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.3. Carrez-Lösung II: 10,6 g Kaliumhexacyanoferrat(II), K₄Fe(CN)₆·3H₂O, werden in Wasser gelöst und mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt.

3.4. Aktivkohle, keinen Harnstoff adsorbierend (zu prüfen).

3.5. Harnstofflösung (Massenkonzentration = 0,1 %).

4. Geräte

4.1. Mechanisches Schüttelgerät: ca. 35 bis 40 min^-1.

4.2. Reagenzgläser: 160 × 16 mm, mit Schliffstopfen.

4.3. Spektralfotometer.

5. Verfahren

5.1. Analysengang der Probe

Von der Probe werden 2 g auf 1 mg genau eingewogen und mit 1 g Aktivkohle (Nummer 3.4) in einen 500-ml-Messkolben gebracht. Hierzu werden 400 ml Wasser und 5 ml Carrez-Lösung I (Nummer 3.2) gegeben, ca. 30 s gemischt und dann 5 ml Carrez-Lösung II (Nummer 3.3) zugesetzt. Das Ganze wird 30 min lang im Schüttelgerät rotiert. Dann wird mit Wasser zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und filtriert.

Von den klaren und farblosen Filtraten werden je 5 ml in je ein Reagenzglas mit Schliffstopfen pipettiert, 5 ml 4-DMAB-Lösung (Nummer 3.1) zugesetzt und gemischt. Die Gläser werden in einem Wasserbad bei 20 °C (+/- 4 °C) temperiert. Nach 15 min wird die Extinktion der Probenlösung im Vergleich mit der Blindprobenlösung der Reagenzien im Spektralfotometer bei 420 nm gemessen.

5.2. Kalibrationskurve

Volumen von 1, 2, 4, 5 bzw. 10 ml Harnstofflösung (Nummer 3.5) werden entnommen, in je 100-ml-Messkolben gebracht und mit Wasser zur Marke aufgefüllt. Von jeder Lösung werden 5 ml mit je 5 ml 4-DMAB-Lösung (Nummer 3.1) gemischt. Die Extinktion wird, wie oben angegeben, im Vergleich mit einer Lösung, die 5 ml 4-DMAB und 5 ml harnstofffreies Wasser enthält, gemessen. Es wird eine Kalibrationskurve aufgestellt.

6. Berechnung der Ergebnisse

Mithilfe der Kalibrationskurve ist die Menge an Harnstoff in der Probe zu bestimmen.

Das Ergebnis ist in mg Harnstoff pro kg Probe auszudrücken.

7. Beurteilung des Verfahrens

7.1. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in ein und demselben Labor und durch denselben Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• Bei 420 nm
  • 50 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3.000 mg/kg bis unter 5.000 mg/kg Harnstoff,
  • 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 5.000 mg/kg bis unter 7.000 mg/kg Harnstoff,
  • 20 % des höheren Werts bei Gehalten von 7.000 mg/kg Harnstoff oder mehr.
• Bei 435 nm
  • 40 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3.000 mg/kg bis unter 5.000 mg/kg Harnstoff,
  • 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 5.000 mg/kg bis unter 9.000 mg/kg Harnstoff,
  • 5 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 9.000 mg/kg Harnstoff oder mehr.

7.2. Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien und/oder durch unterschiedliche Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• Bei 420 nm
  • 3.000 mg/kg absolut bei Gehalten von 3.000 mg/kg bis unter 12.000 mg/kg,
  • 4.500 mg/kg absolut bei Gehalten von 12.000 mg/kg oder mehr.
• Bei 435 nm
  • 50 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 3.000 mg/kg bis unter 8.000 mg/kg Harnstoff,
  • 25 % relativ zum höheren Wert bei Gehalten von 8.000 mg/kg Harnstoff oder mehr.

8. Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EU-Laborvergleichstest durchgeführt, an dem 18 Laboratorien teilnahmen. Es wurden 5 positive Proben eines Mischfuttermittels für Wiederkäuer (in den Tabellen 1 und 2 als "MAT" bezeichnet) als Doppelblindproben untersucht (1 Untersuchung) und eine Leerprobe eines Mischfuttermittels für Wiederkäuer wurde einmalig untersucht.

Die Wiederholgrenze (r) und die Vergleichsgrenze (R) wurden gemäß den internationalen Leitlinien berechnet, nachdem mithilfe einer Varianzanalyse der gültigen Werte Ausreißer eliminiert wurden.

Die für die Methode berechneten Leistungszahlen (Wiederholbarkeit, Vergleichbarkeit) sind in den nachstehenden Tabellen dargestellt. Bei der Untersuchung der Gesamtheit der Proben einschließlich des Blindmaterials wurden keine falsch positiven und keine falsch negativen Proben festgestellt.

Tabelle 1: Leistungseigenschaften der Methoden für Harnstoff bei λ = 420 nm in Bezug auf alle Materialien

Tabelle 2: Leistungseigenschaften der Methoden für Harnstoff bei λ = 435 nm in Bezug auf alle Materialien

9. Bemerkungen

9.1. Bei einem Harnstoffgehalt von mehr als 3 % ist die Einwaage auf 1 g zu reduzieren bzw. die Anfangslösung so weit zu verdünnen, dass in 500 ml höchstens 50 mg Harnstoff enthalten sind.

9.2. Bei niedrigen Harnstoffgehalten wird die Einwaage erhöht, soweit das Filtrat klar und farblos bleibt.

9.3. Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen der Ringversuche ergibt sich kein nennenswerter Unterschied bei der Präzision der Messung von Harnstoff bei 420 nm im Vergleich zu 435 nm.

E. Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren (Außer Tryptophan)

Die zur Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren (außer Tryptophan) anzuwendenden Analysemethoden sind die folgenden:

• EN ISO 13903: Futtermittel - Bestimmung des Aminosäuregehalts,
• EN ISO 17180: Futtermittel - Bestimmung von Lysin, Methionin und Threonin in handelsüblichen aminosäurehaltigen Produkten und Vormischungen ⁴,
• die unter den folgenden Nummern 1 bis 10 beschriebene Analysemethode.

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gehalt der freien (synthetischen und natürlichen) sowie der gesamten (peptidgebundenen und freien) Aminosäuren in Futtermittel-Ausgangserzeugnissen, Mischfuttermitteln und Vormischungen, die weniger als 10 % ⁵ der einzelnen Aminosäuren enthalten, unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmen. Die Methode ist für folgende Aminosäuren anwendbar: Cyst(e)in, Methionin, Lysin, Threonin, Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tyrosin und Valin.

Die Methode unterscheidet nicht zwischen den verschiedenen Aminosäuresalzen und kann nicht zwischen D- und L-Formen von Aminosäuren differenzieren. Sie ist nicht zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan oder Hydroxyanaloga der Aminosäuren anwendbar.

2. Prinzip

2.1. Freie Aminosäuren

Die freien Aminosäuren werden mit verdünnter Salzsäure extrahiert. Mitextrahierte stickstoffhaltige Makromoleküle werden mit Sulfosalicylsäure ausgefällt und durch Filtrieren entfernt. Die filtrierte Lösung wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm bestimmt.

2.2. Gesamtaminosäuren

Die gewählte Methode hängt von den zu untersuchenden Aminosäuren ab. Cyst(e)in und Methionin müssen vor der Hydrolyse zu Cysteinsäure bzw. Methioninsulfon oxidiert werden. Tyrosin muss im Hydrolysat der nicht oxidierten Probe bestimmt werden. Alle übrigen unter Nummer 1 (Zweck und Anwendungsbereich) genannten Aminosäuren können aus dem Hydrolysat der oxidierten oder der nicht oxidierten Probe bestimmt werden.

Die Oxidation wird bei 0 °C mit einer Perameisensäure-Phenol-Mischung durchgeführt. Überschüssiges Oxidationsreagenz wird mit Natriumdisulfit zerstört. Die oxidierte bzw. die nicht oxidierte Probe wird mit Salzsäure (Nummer 3.20) 23 h lang hydrolysiert. Das Hydrolysat wird auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt. Die Aminosäuren werden durch Ionenaustauschchromatografie getrennt und nach Reaktion mit Ninhydrin durch fotometrischen Nachweis bei 570 nm (bei Prolin 440 nm) bestimmt.

3. Reagenzien

Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μ S/cm).

3.1. Wasserstoffperoxid, w (Massenanteil) = 30 %.

3.2. Ameisensäure, w (Massenanteil) = 98 bis 100 %.

3.3. Phenol.

3.4. Natriumdisulfit.

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. 5-Sulfosalicylsäure-Dihydrat.

3.7. Salzsäure, Dichte ca. 1,18 g/ml.

3.8. Tri-Natriumcitrat-Dihydrat.

3.9. 2,2"-Thiodiethanol (Thiodiglycol).

3.10. Natriumchlorid.

3.11. Ninhydrin.

3.12. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.13. Norleucin oder sonstige für die Verwendung als interner Standard geeignete Verbindung.

3.14. Stickstoffgas (< 10 ppm Sauerstoff).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Aminosäuren.

3.16.1. Standardstoffe der unter Nummer 1 (Zweck und Anwendungsbereich) aufgeführten Aminosäuren. Es dürfen nur reine Verbindungen ohne Kristallwasser verwendet werden. Sie sind vor der Verwendung 1 Woche lang im Vakuum über P₂O₅ oder H₂SO₄ zu trocknen.

3.16.2. Cysteinsäure.

3.16.3. Methioninsulfon.

3.17. Natriumhydroxidlösung, c = 7,5 mol/l:

300 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.18. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:

40 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und auf 1 l auffüllen.

3.19. Phenolhaltige Ameisensäurelösung:

889 g Ameisensäure (Nummer 3.2) werden mit 111 g Wasser gemischt; anschließend werden 4,73 g Phenol (Nummer 3.3) hinzugefügt.

3.20. Hydrolysemischung, c = 6 mol HCl/l unter Zusatz von 1 g Phenol/l:

Zu 492 ml HCl (Nummer 3.7) wird 1 g Phenol (Nummer 3.3) hinzugefügt und mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.21. Extraktionslösung, c = 0,1 mol HCl/l, 2 % Thiodiglycol enthaltend: 8,2 ml HCl (Nummer 3.7) werden in ca. 900 ml Wasser gegeben, 20 ml Thiodiglycol (Nummer 3.9) werden hinzugefügt, und es wird mit Wasser auf 1 l aufgefüllt (Nummer 3.7 und 3.9 dürfen nicht unmittelbar gemischt werden).

3.22. 5-Sulfosalicylsäurelösung, β = 6 %:

60 g 5-Sulfosalicylsäure (Nummer 3.6) in Wasser lösen und mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.23. Oxidationsmischung (Perameisensäure-Phenol):

0,5 ml Wasserstoffperoxid (Nummer 3.1) werden mit 4,5 ml phenolhaltiger Ameisensäurelösung (Nummer 3.19) in einem kleinen Becherglas gemischt. Es wird bei 20 bis 30 °C 1 h lang stehen gelassen, um die Bildung von Perameisensäure zu bewirken. Anschließend wird die Lösung 15 min lang in ein Eisbad gestellt, bevor sie der Probe zugegeben wird.

Vorsicht: Hautkontakt vermeiden und Schutzkleidung tragen.

3.24. Citratpufferlösung, c = 0,2 mol Na⁺/l, pH 2,20:

19,61 g Natriumcitrat (Nummer 3.8), 5 ml Thiodiglycol (Nummer 3.9), 1 g Phenol (Nummer 3.3) und 16,50 ml HCl (Nummer 3.7) werden in ca. 800 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird auf 2,20 eingestellt. Mit Wasser auf 1 l auffüllen.

3.25. Elutionspuffer entsprechend den Anforderungen des verwendeten Analysators (Nummer 4.9).

3.26. Ninhydrinreagenz entsprechend den Bedingungen des verwendeten Analysators (Nummer 4.9).

3.27. Aminosäuren-Standardlösungen: Diese Lösungen sind bei < 5 °C aufzubewahren.

3.27.1. Aminosäuren-Standard-Stammlösung (Nummer 3.16.1):

c = 2,5 μmol/ml je Aminosäure in Salzsäure.

Diese Lösung ist im Handel erhältlich.

3.27.2. Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml:

0,2115 g Cysteinsäure (Nummer 3.16.2) und 0,2265 g Methioninsulfon (Nummer 3.16.3) werden in Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einem 1000-ml-Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung zur Marke aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 12 Monate haltbar. Sie wird nicht benötigt, falls die Standard-Stammlösung (Nummer 3.27.1) bereits Cysteinsäure und Methioninsulfon enthält.

3.27.3. Stammlösung des internen Standards, z.B. Norleucin, c = 20 μmol/ml:

0,6560 g Norleucin (Nummer 3.13) werden in Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einem Messkolben gelöst, und es wird mit Citratpufferlösung auf 250 ml aufgefüllt. Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 6 Monate haltbar.

3.27.4. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl Cysteinsäure und Methioninsulfon und c = 10 nmol/50 μl der übrigen Aminosäuren: 2,2 g Natriumchlorid (Nummer 3.10) werden in einem 100-ml-Becherglas in 30 ml Citratpufferlösung (Nummer 3.24) gelöst. Es werden 4,00 ml Standard-Stammlösung der Aminosäuren (Nummer 3.27.1), 4,00 ml Standard-Stammlösung von Cysteinsäure und Methioninsulfon (Nummer 3.27.2), und, falls verwendet, 0,50 ml Stammlösung des internen Standards (Nummer 3.27.3) hinzugefügt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (Nummer 3.18) auf 2,20 eingestellt.

Die Lösung wird quantitativ in einen 50-ml-Messkolben überführt, und es wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt und gemischt.

Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 3 Monate haltbar.

Siehe auch die Bemerkungen unter 9.1.

3.27.5. Aminosäurenkalibrierlösung zur Verwendung bei Hydrolysaten gemäß Nummer 5.3.3.1 und bei Extrakten gemäß Nummer 5.2. Die Kalibrierlösung wird gemäß Nummer 3.27.4 hergestellt, jedoch ohne Zugabe von Natriumchlorid.

Die Lösung ist bei < 5 °C höchstens 3 Monate haltbar.

4. Geräte

4.1. 100- oder 250-ml-Rundkolben mit Rückflusskühler.

4.2. Ofenfeste 100-ml-Borosilikat-Glasflaschen mit Schraubverschluss mit Gummidichtung/teflonbeschichteter Dichtung (z.B. Duran, Schott).

4.3. Trockenschrank mit forcierter Umluft, auf ± 2 °C regelbar.

4.4. pH-Meter (auf drei Dezimalstellen genau).

4.5. Membranfilter, 0,22 μm Porengröße.

4.6. Zentrifuge.

4.7. Vakuum-Rotationsverdampfer.

4.8. Mechanischer Schüttler oder Magnetrührer.

4.9. Aminosäureanalysator oder HPLC-Einrichtung mit Ionenaustauschersäule, Einrichtung für Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung und Fotometer.

Die Säule wird mit sulfoniertem Polystyrolharz gefüllt, das die Trennung der einzelnen Aminosäuren und deren Abtrennung von sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen ermöglicht. Die Pumpen für die Ninhydrin- und für die Pufferlösungen müssen über den Zeitraum des Kalibrationslaufes und des Probenlaufes eine Flussstabilität von ± 0,5 % gewährleisten.

Bei einigen Aminosäureanalysatoren können auch Hydrolyseverfahren angewandt werden, wenn die Hydrolysate Natriumionenkonzentrationen von c = 0,8 mol/l aufweisen und die restliche Ameisensäure des Oxidationsschrittes enthalten. Andere Analysatoren bieten keine befriedigende Abtrennung bestimmter Aminosäuren, falls das Hydrolysat überschüssige Ameisensäure und/oder hohe Natriumionenkonzentrationen aufweist. In diesem Fall wird das Säurevolumen nach der Hydrolyse und vor der pH-Wert-Einstellung durch Einengen auf ca. 5 ml reduziert. Das Einengen ist unter Vakuum bei höchstens 40 °C vorzunehmen.

5. Verfahren

5.1. Vorbereitung der Probe

Die Probe wird so fein zermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Zermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 °C luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Zermahlen mit Petrolether (Nummer 3.12) zu extrahieren.

5.2. Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 0,2 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen und 100,0 ml Extraktionslösung (Nummer 3.21) hinzufügen. Mit einem mechanischen Schüttler 60 min lang schütteln bzw. mit einem Magnetrührer (Nummer 4.8) rühren. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein 100-ml-Becherglas pipettieren.

Es werden 5,0 ml Sulfosalicylsäurelösung (Nummer 3.22) unter Rühren hinzugefügt, und mithilfe des Magnetrührers wird 5 min lang weitergerührt. Die überstehende Lösung wird filtriert oder zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Von der so erhaltenen Lösung werden 10,0 ml in ein 100-ml-Becherglas gegeben, und unter Verwendung von Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.18) wird der pH-Wert auf 2,20 eingestellt. Die Lösung wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in einen Messkolben geeigneter Größe überführt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt.

Bei Verwendung eines internen Standards werden vor dem Auffüllen 1,00 ml der Stammlösung des internen Standards (Nummer 3.27.3) für jeweils 100 ml Endlösung hinzugefügt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchgeführt.

Werden die Extrakte nicht am selben Tag chromatografiert, sind sie bei < 5 °C aufzubewahren.

5.3. Bestimmung des Gehalts an Gesamtaminosäuren

5.3.1. Oxidation

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) werden auf 0,2 mg genau eingewogen

• in einen 100-ml-Rundkolben (Nummer 4.1) für die offene Hydrolyse (Nummer 5.3.2.3) oder
• in einen 250-ml-Rundkolben (Nummer 4.1), falls eine niedrige Natriumionenkonzentration (Nummer 5.3.3.1) erforderlich ist, oder
• in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (Nummer 4.2) für die geschlossene Hydrolyse (Nummer 5.3.2.4).

Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von etwa 10 mg und einen Feuchtigkeitsgehalt von höchstens 100 mg haben.

Der Kolben/die Flasche wird in ein Eisbad gestellt und auf 0 °C abgekühlt. Dann werden 5 ml der Oxidationsmischung (Nummer 3.23) hinzugefügt, und es wird mithilfe eines Glasspatels mit gebogener Spitze gemischt. Der Behälter, der den Spatel enthält, wird mit einer luftdichten Folie verschlossen, das Eiswasserbad wird mit dem verschlossenen Behälter in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von 0 °C gestellt und 16 h lang stehen gelassen. Nach 16 h wird der Behälter aus dem Kühlschrank genommen und das überschüssige Oxidationsreagenz wird durch Zusatz von 0,84 g Natriumdisulfit (Nummer 3.4) zersetzt.

Es wird gemäß Nummer 5.3.2.1 weiterverfahren.

5.3.2. Hydrolyse

5.3.2.1. Hydrolyse der oxidierten Proben

Zu der oxidierten Probe (die gemäß Nummer 5.3.1 vorbereitet wurde) werden 25 ml Hydrolysemischung (Nummer 3.20) gegeben. Dabei ist darauf zu achten, dass alle Probenrückstände, die an den Seitenwänden des Gefäßes sowie am Spatel haften, abgewaschen werden.

Je nach dem angewendeten Hydrolyseverfahren wird gemäß Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.2. Hydrolyse der nicht oxidierten Proben

In einen 100-ml- oder 250-ml-Rundkolben (Nummer 4.1) bzw. in eine 100-ml-Flasche mit Schraubverschluss (Nummer 4.2) werden 0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 0,2 mg genau eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. Vorsichtig 25 ml Hydrolysemischung (Nummer 3.20) hinzufügen und mit der Probe vermischen. Es wird entweder gemäß Nummer 5.3.2.3 oder gemäß Nummer 5.3.2.4 weiterverfahren.

5.3.2.3. Offene Hydrolyse (Rückflusshydrolyse)

Zu der nach Nummer 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 hergestellten Mischung werden 3 Glasperlen hinzugegeben. Sie wird zum Sieden erhitzt und unter Rückfluss 23 h lang am Sieden gehalten. Nach Beendigung der Hydrolyse wird der Rückflusskühler mit 5 ml Citratpufferlösung (Nummer 3.24) gespült und der abgehängte Kolben im Eisbad gekühlt.

Es wird gemäß Nummer 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.2.4. Geschlossene Hydrolyse

Die Flasche mit der nach Nummer 5.3.2.1 oder 5.3.2.2 vorbereiteten Mischung wird bei 110 °C in den Trockenschrank (Nummer 4.3) gestellt. Um einen durch Gasentwicklung hervorgerufenen Druckaufbau zu vermeiden und eine Explosion zu verhindern, wird der Schraubverschluss während der ersten Stunde nur lose auf die Flasche gelegt. Die Flasche darf nicht verschlossen werden. Nach 1 h wird die Flasche mit dem Deckel fest verschlossen und 23 h lang im Trockenschrank (Nummer 4.3) belassen. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Flasche aus dem Trockenschrank genommen, der Verschluss vorsichtig geöffnet, die Flasche in ein Eisbad gestellt und abkühlen gelassen.

Je nach dem Verfahren für die pH-Wert-Einstellung (Nummer 5.3.3) wird der Inhalt der Flasche quantitativ mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) in ein 250-ml-Becherglas oder in einen 250-ml-Rundkolben überführt.

Es wird gemäß Nummer 5.3.3 weiterverfahren.

5.3.3. pH-Wert-Einstellung

Je nach der Natriumionentoleranz des Aminosäureanalysators (Nummer 4.9) wird die pH-Wert-Einstellung gemäß Nummer 5.3.3.1 oder 5.3.3.2 vorgenommen.

5.3.3.1. Für chromatografische Systeme (Nummer 4.9), die eine niedrige Natriumionenkonzentration erfordern

Werden Aminosäureanalysatoren verwendet, bei denen eine geringe Natriumionenkonzentration erforderlich ist (wenn also das Säurevolumen reduziert werden muss), wird die Verwendung einer Stammlösung eines internen Standards (Nummer 3.27.3) empfohlen.

In diesem Fall sind dem Hydrolysat vor dem Verdampfen 2,00 ml der internen Standardlösung (Nummer 3.27.3) hinzuzufügen.

Zu dem nach Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysat werden 2 Tropfen 1-Octanol (Nummer 3.15) gegeben.

Das Volumen wird mithilfe eines Rotationsverdampfers (Nummer 4.7) unter Vakuum bei 40 °C auf 5 bis 10 ml reduziert. Wurde das Volumen beim Einengen versehentlich auf weniger als 5 ml reduziert, wird das Hydrolysat verworfen und die Analyse wiederholt.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.18) auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß Nummer 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.3.2. Für alle sonstigen Aminosäureanalysatoren (Nummer 4.9)

Die nach Nummer 5.3.2.3 oder 5.3.2.4 erhaltenen Hydrolysate werden durch vorsichtige Zugabe unter Rühren von 17 ml Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.17) teilweise neutralisiert, wobei eine Temperatur von unter 40 °C eingehalten werden muss.

Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.17 und anschließend 3.18) bei Raumtemperatur auf 2,20 eingestellt, und es wird gemäß Nummer 5.3.4 weiterverfahren.

5.3.4. Probenlösung für die Chromatografie

Das auf pH 2,20 eingestellte Hydrolysat (Nummer 5.3.3.1 oder 5.3.3.2) wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) quantitativ in einen 200-ml-Messkolben überführt und mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt.

Falls bisher noch kein interner Standard hinzugefügt worden ist, werden vor dem Auffüllen 2,00 ml des internen Standards (Nummer 3.27.3) hinzugegeben und dann mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) zur Marke aufgefüllt. Es wird sorgfältig gemischt.

Anschließend wird die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchgeführt.

Falls die Probenlösungen nicht am selben Tag chromatografiert werden, sind sie bei < 5 °C aufzubewahren.

5.4. Chromatografie

Falls erforderlich, wird der Extrakt (Nummer 5.2) oder das Hydrolysat (Nummer 5.3.4) vor der Chromatografie auf Raumtemperatur gebracht. Die Mischung wird geschüttelt und es wird eine geeignete Menge durch einen 0,22-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird der Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bzw. einer HPLC-Einrichtung (Nummer 4.9) unterzogen.

Die Einspritzung kann von Hand oder automatisch erfolgen. Wesentlich ist, dass jeweils die gleiche Menge ± 0,5 % der Standardlösung und der Probenlösung eingespritzt wird, es sei denn, es wird ein interner Standard verwendet. Das Verhältnis der Konzentrationen von Natriumionen und Aminosäuren sollte in der Standard- und der Probenlösung so ähnlich wie möglich sein.

Die Häufigkeit von Kalibrationsläufen hängt von der Stabilität des Ninhydrinreagenzes und des Analysatorsystems ab. Die Standardlösung oder die Probenlösung wird mit Citratpufferlösung (Nummer 3.24) so verdünnt, dass die Peakfläche des Standards etwa 30 bis 200 % der Peakfläche der einzelnen Aminosäuren in der Probenlösung ausmacht.

Die Chromatografie der Aminosäuren unterscheidet sich leicht je nach Art des verwendeten Analysators und des eingesetzten Harzes. Das System muss in der Lage sein, die Aminosäuren vollständig voneinander und von den sonstigen Ninhydrin-positiven Substanzen zu trennen. Im Betriebsbereich muss das chromatografische System bei Änderungen der Aminosäuremengen, die der Säule hinzugefügt werden, eine lineare Reaktion aufweisen.

Wird eine equimolare Lösung der zu bestimmenden Aminosäuren analysiert, sollten bei der Chromatografie die unten angegebenen Verhältnisse von Tal zu Peakhöhe zwischen den überlappenden Peaks erreicht werden. Diese equimolare Lösung muss mindestens 30 % der maximalen Menge jeder Aminosäure enthalten, die mit dem jeweiligen Aminosäureanalysator (Nummer 4.9) noch präzise bestimmt werden kann.

Für die Trennung von Threonin-Serin darf das Verhältnis von Tal zur Peakhöhe des niedrigeren der 2 sich überlappenden Peaks auf dem Chromatogramm nicht mehr als 2:10 betragen (wenn nur Cyst(e)in, Methionin, Threonin und Lysin bestimmt werden, beeinträchtigt eine unzureichende Trennung von angrenzenden Peaks die Bestimmung). Für alle übrigen Aminosäuren sollte die Trennung besser als 1:10 sein.

Das System muss gewährleisten, dass Lysin von "Lysinartefakten" und Omithin abgetrennt wird.

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Flächen der Proben- und der Kalibrationsstandardpeaks werden für jede einzelne Aminosäure bestimmt und der Gehalt (X) in g Aminosäure je kg Probe berechnet:

Bei Verwendung eines internen Standards ist zu multiplizieren mit D/C

Sowohl Cystin als auch Cystein werden im Hydrolysat der oxidierten Probe als Cysteinsäure bestimmt, jedoch als Cystin (C₆H₁₂N₂O₄S₂, M = 240,30 g/mol) unter Verwendung der Molmasse von 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol) berechnet.

Methionin wird als Methioninsulfon in Hydrolysaten der oxidierten Probe bestimmt, aber unter Verwendung des M von Methionin (149,21 g/mol) als Methionin berechnet.

Zugesetztes freies Methionin wird nach Extraktion als Methionin bestimmt, wobei für die Berechnung das gleiche M verwendet wird.

6.1. Das Gesamtverdünnungsvolumen der Extrakte (F) für die Bestimmung des Gehalts an freien Aminosäuren (Nummer 5.2) wird wie folgt berechnet:

7. Beurteilung des Verfahrens

Das Verfahren wurde in einem auf internationaler Ebene im Jahr 1990 durchgeführten Vergleichstest an 4 verschiedenen Futtermitteln (Mischfuttermittel für Schweine, Mischfuttermittel für Masthähnchen, Eiweißkonzentrat und einer Vormischung) erprobt.

Die nach der Eliminierung von Ausreißern erhaltenen Ergebnisse des Vergleichstests aus dem Jahr 1990 (Mittelwerte und Standardabweichungen) sind in den Tabellen unter diesem Punkt dargestellt.

Mittelwerte in g/kg

7.1. Wiederholbarkeit

Die Wiederholbarkeit wird als Standardabweichung der Wiederholbarkeit beim in der vorstehenden Tabelle dargestellten Vergleichstest ausgedrückt und ist in der folgenden Tabelle dargestellt:

Variationskoeffizient der Wiederholbarkeit (%) (VK_r)

7.2. Vergleichbarkeit

Die Ergebnisse hinsichtlich der Standardabweichung der Vergleichbarkeit, die sich aus dem oben genannten Vergleichstest ergeben, sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Variationskoeffizient der Vergleichbarkeit (%) (VK_R)

8. Verwendung von Referenzmaterialien

Die korrekte Anwendung der Methode ist durch Mehrfachbestimmungen an zertifizierten Referenzmaterialien (soweit verfügbar) zu überprüfen. Für die Kalibration wird die Verwendung einer zertifizierten Aminosäurestandardlösung empfohlen.

9. Bemerkungen

9.1. Wegen der Unterschiede zwischen den Aminosäureanalysatoren sind die Endkonzentrationen der Aminosäurenkalibrierlösungen (vgl. Nummer 3.27.4 und 3.27.5) und der Hydrolysate (vgl. Nummer 5.3.4) als Richtwerte anzusehen.

Der lineare Reaktionsbereich des Geräts muss für alle Aminosäuren geprüft werden.

Die Standardlösung wird mit Citratpufferlösung verdünnt, um Peakflächen in der Mitte des Bereichs zu erhalten.

9.2. Falls Geräte für die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie zur Analyse der Hydrolysate eingesetzt werden, sind die Versuchsbedingungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu optimieren.

9.3. Wird diese Methode für Mischfuttermittel oder Vormischungen angewandt, die mehr als 1 % Chlorid enthalten (Kraftfuttermittel, Mineralfuttermittel, Ergänzungsfuttermittel), so könnte der Methioningehalt unterschätzt werden, und es ist eine modifizierte Oxidation erforderlich.

10. Leistungskriterien

Aus der Zusammenstellung der Ergebnisse (außer für Tyrosin) der 2 Ringversuche (aus dem Jahr 1990, wie unter Nummer 7 beschrieben, bzw. aus dem Jahr 2005, wie in EN/ISO 13903 beschrieben) ergeben sich die nachstehenden Kriterien für die Wiederholbarkeit und die Vergleichbarkeit. Die bei diesen 2 Laborvergleichstests erzielten Werte sind möglicherweise nicht auf andere als die genannten Konzentrationsbereiche und Matrizen anwendbar.

10.1. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in ein und demselben Labor und durch denselben Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• 6 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glycin, Alanin, Lysin, Prolin, Glutaminsäure, Isoleucin und Histidin;
• 8 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Threonin, Phenylalanin, Methionin, Asparaginsäure und Leucin;
• 10 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Arginin und Valin;
• 12 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Serin;
• 15 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Cyst(e)in.

10.2. Vergleichbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe in unterschiedlichen Laboratorien und/oder durch unterschiedliche Bearbeiter darf die folgenden Werte nicht überschreiten:

• 15 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glycin, Alanin und Threonin;
• 20 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Lysin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Asparaginsäure;
• 22 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Glutaminsäure und Leucin;
• 27 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Arginin;
• 32 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Isoleucin;
• 35 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Valin und Serin;
• 40 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Histidin;
• 50 % relativ zum höheren Wert beim Gesamtaminosäuregehalt im Fall von Cyst(e)in.

F. Bestimmung des Tryptophangehalts

Die zur Bestimmung des Gehalts an Tryptophan anzuwendenden Analysemethoden sind die folgenden:

• EN ISO 13904: Futtermittel - Bestimmung des Tryptophangehalts,
• die unter den folgenden Nummern 1 bis 9 beschriebene Analysemethode.

1. Zweck und Anwendungsbereich

Mit der Methode lässt sich der Gesamtgehalt an Tryptophan und der Gehalt an freiem Tryptophan in Futtermitteln bestimmen. Sie differenziert nicht zwischen D- und L-Formen.

2. Prinzip

Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Tryptophan wird die Probe unter alkalischen Bedingungen mit gesättigter Bariumhydroxid-Lösung hydrolysiert, auf 110 °C erhitzt und 20 h lang auf dieser Temperatur gehalten. Nach der Hydrolyse wird ein interner Standard zugegeben.

Zur Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan wird die Probe unter leicht sauren Bedingungen in Gegenwart eines internen Standards extrahiert.

Tryptophan und der interne Standard im Hydrolysat bzw. im Extrakt werden durch HPLC mit Fluoreszenzdetektor bestimmt.

3. Reagenzien

3.1. Es ist bidestilliertes Wasser oder Wasser gleichwertiger Qualität zu verwenden (Leitfähigkeit < 10 μS/cm).

3.2. Standardsubstanz: Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.3. Interner Standard: α-Methyl-Tryptophan (Reinheit/Gehalt ≥ 99 %), im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

3.4. Bariumhydroxid-Octahydrat (das Ba(OH)₂·8H₂O darf nicht übermäßig der Luft ausgesetzt werden, um die Bildung von BaCO₃ zu vermeiden, das die Bestimmung beeinträchtigen könnte) (siehe Bemerkung 9.3).

3.5. Natriumhydroxid.

3.6. Orthophosphorsäure, w (Massenanteil) = 85 %.

3.7. Salzsäure, ρ₂₀ = 1,19 g/ml.

3.8. Methanol, HPLC-Qualität.

3.9. Petrolether, Siedeintervall 40 bis 60 °C.

3.10. Natriumhydroxidlösung, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (Nummer 3.5) in Wasser lösen und mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l auffüllen.

3.11. Salzsäure, c = 6 mol/l:

492 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.12. Salzsäure, c = 1 mol/l:

82 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.13. Salzsäure, c = 0,1 mol/l:

8,2 ml HCl (Nummer 3.7) werden mit Wasser auf 1 l aufgefüllt.

3.14. Orthophosphorsäure, c = 0,5 mol/l:

34 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.6) werden mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l aufgefüllt.

3.15. Konzentrierte Tryptophanlösung (Nummer 3.2), c = 2,50 μmol/ml:

0,2553 g Tryptophan (Nummer 3.2) werden in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (Nummer 3.13) gelöst und mit Salzsäure (Nummer 3.13) zur Marke aufgefüllt. Bei -18 °C höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.16. Konzentrierte interne Standardlösung, c = 2,50 μmol/ml:

0,2728 g α-Methyl-Tryptophan (Nummer 3.3) werden in einem 500-ml-Messkolben in Salzsäure (Nummer 3.13) gelöst und mit Salzsäure (Nummer 3.13) zur Marke aufgefüllt. Bei -18 °C höchstens 4 Wochen aufbewahren.

3.17. Kalibrierstandardlösung von Tryptophan und internem Standard:

2,00 ml konzentrierte Tryptophanlösung (Nummer 3.15) und 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (Nummer 3.16) werden mit Wasser (Nummer 3.1) und Methanol (Nummer 3.8) auf etwa dasselbe Volumen und etwa dieselbe Methanolkonzentration (10 bis 30 %) wie das fertige Hydrolysat verdünnt.

Diese Lösung muss vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

Während der Zubereitung vor direktem Sonnenlicht schützen.

3.18. Essigsäure.

3.19. 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol.

3.20. Ethanolamin, w (Massenanteil) > 98 %.

3.21. Lösung von 1 g 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Nummer 3.19) in 100 ml Methanol (Nummer 3.8).

3.22. Mobile Phase für die HPLC: 3,00 g Essigsäure (Nummer 3.18) + 900 ml Wasser (Nummer 3.1) + 50,0 ml Lösung (Nummer 3.21) von 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Nummer 3.19) in Methanol (Nummer 3.8) (1 g/100 ml). Den pH-Wert mit Ethanolamin (Nummer 3.20) auf 5,0 einstellen. Mit Wasser (Nummer 3.1) auf 1 l auffüllen.

4. Geräte

4.1. HPLC-Einrichtung mit Fluoreszenzdetektor.

4.2. HPLC-Trennsäule, 125 × 4 mm, C₁₈, 3 μm Korngröße, oder vergleichbare Säule.

4.3. pH-Meter.

4.4. Polypropylen-Kolben, 125 ml, Weithals mit Schraubverschluss.

4.5. Membranfilter, 0,45 μm Porengröße.

4.6. Autoklav, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bar.

4.7. Mechanisches Schüttelgerät oder Magnetrührer.

4.8. Vortex-Schüttelgerät.

5. Verfahren

5.1. Vorbereitung der Proben

Die Probe wird so fein zermahlen, dass sie ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite passieren kann. Proben mit hohem Feuchtigkeitsgehalt müssen vor dem Zermahlen entweder bei einer Temperatur von höchstens 50 °C luftgetrocknet oder aber gefriergetrocknet werden. Proben mit hohem Fettgehalt sind vor dem Zermahlen mit Petrolether (Nummer 3.9) zu extrahieren.

5.2. Bestimmung des Gehalts an freiem Tryptophan (Extrakt)

Eine geeignete Menge (1 bis 5 g) der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) auf 1 mg genau in einen Erlenmeyerkolben einwiegen. 100,0 ml Salzsäure (Nummer 3.13) und 5,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (Nummer 3.16) zugeben. Mit einem mechanischen Schüttler oder einem Magnetrührer (Nummer 4.7) 60 min lang schütteln bzw. mischen. Absetzen lassen und 10,0 ml der überstehenden Lösung in ein Becherglas pipettieren. 5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.14) zugeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxidlösung (Nummer 3.10) auf 3 eingestellt. Ausreichend Methanol (Nummer 3.8) für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (entspricht etwa dem Volumen der Kalibrierstandardlösung (Nummer 3.17)).

Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchführen.

Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Extrakte am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 °C maximal 3 Tage aufbewahrt werden.

5.3. Bestimmung des Gehalts an Gesamttryptophan (Hydrolysat)

0,1 bis 1 g der vorbereiteten Probe (Nummer 5.1) werden auf 0,2 mg genau in den Polypropylenkolben (Nummer 4.4) eingewogen. Die Einwaage muss einen Stickstoffgehalt von ca. 10 mg aufweisen. 8,4 g Bariumhydroxid-Octahydrat (Nummer 3.4) und 10 ml Wasser zugeben. Mithilfe eines Vortex-Schüttelgeräts (Nummer 4.8) oder Magnetrührgeräts (Nummer 4.7) mischen. Den teflonbeschichteten Magneten in der Mischung lassen. Die Gefäßwände mit 4 ml Wasser abspülen. Schraubkappe aufsetzen und Kolben locker verschließen. In einen Autoklaven (Nummer 4.6) mit kochendem Wasser überführen und 30 bis 60 min lang dämpfen lassen. Den Autoklaven schließen und 20 h lang bei 110 (± 2) °C autoklavieren.

Vor dem Öffnen des Autoklaven ist die Temperatur auf knapp unter 100 °C zu senken. Um eine Kristallisation des Ba(OH)₂·8H₂O zu vermeiden, sind der warmen Mischung 30 ml Wasser mit Zimmertemperatur zuzugeben. Leicht schütteln oder rühren. 2,00 ml konzentrierte interne Standardlösung (α-Methyl-Tryptophan) (Nummer 3.16) zugeben. Die Gefäße im Wasser-/Eisbad 15 min lang kühlen.

Anschließend 5 ml Orthophosphorsäure (Nummer 3.14) zugeben. Das Gefäß im Kühlbad belassen und unter Rühren mit HCl (Nummer 3.11) neutralisieren; der pH-Wert wird mit HCl (Nummer 3.12) auf 3,0 eingestellt. Ausreichend Methanol für eine Methanolkonzentration von 10 bis 30 % im Endvolumen zugeben. In einen Messkolben mit ausreichendem Volumen überführen und mit Wasser auf das für die Chromatografie notwendige Volumen verdünnen (z.B. 100 ml). Die Zugabe von Methanol darf keine Präzipitation verursachen.

Einige ml der Lösung werden vor der Einspritzung in die HPLC-Säule durch einen 0,45-μm-Membranfilter (Nummer 4.5) filtriert. Die Chromatografie gemäß Nummer 5.4 durchführen.

Standardlösung und Extrakte sind vor direktem Sonnenlicht zu schützen. Falls es nicht möglich ist, die Hydrolysate am selben Tag zu analysieren, können sie bei 5 °C höchstens 3 Tage aufbewahrt werden.

5.4. HPLC-Bestimmung

Die folgenden Angaben für eine isokratische Trennung sind Richtwerte; andere Parameter können verwendet werden, sofern sie zu vergleichbaren Ergebnissen führen (siehe auch Bemerkungen 9.1 und 9.2):

6. Berechnung der Ergebnisse

Die Menge von Tryptophan (X) in g je 100 g Probe wird wie folgt berechnet:

7. Wiederholbarkeit

Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf 10 % des höheren Werts nicht überschreiten.

8. Ergebnisse eines Ringversuchs

Es wurde ein EU-Ringversuch (4. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 3 Proben von bis zu 12 Laboratorien analysiert wurden, um die Hydrolysemethode zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

Es wurde ein weiterer EU-Ringversuch (3. Vergleichstest) durchgeführt, bei dem 2 Proben von bis zu 13 Laboratorien analysiert wurden, um die Methode zur Extraktion von freiem Tryptophan zu zertifizieren. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst.

Es wurde ein weiterer EU-Vergleichstest durchgeführt, bei dem 4 Proben von bis zu 7 Laboratorien analysiert wurden, um die Tryptophan-Hydrolyse zu zertifizieren. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefasst. Jede Probe wurde mehrfach (5-mal) analysiert.

9. Bemerkungen

9.1. Mit den folgenden besonderen Chromatografiebedingungen kann eine bessere Trennung von Tryptophan und α-Methyl-Tryptophan erreicht werden.

Isokratische Trennung, gefolgt von der Reinigung der Gradientensäule:

9.2. Die Durchführung der Chromatografie variiert je nach Art der HPLC und der verwendeten Säulenpackung. Das System muss so gewählt werden, dass eine Grundlinientrennung zwischen Tryptophan und dem internen Standard möglich ist. Die Abbauprodukte müssen deutlich von Tryptophan und dem internen Standard getrennt werden. Zur Untersuchung der Grundlinie unter dem internen Standard auf Verunreinigungen sind Hydrolysate ohne internen Standard zu analysieren. Die Laufzeit muss lang genug sein, dass alle Abbauprodukte eluiert werden, andernfalls können späte Elutionspeaks anschließende Chromatografiedurchgänge beeinträchtigen.

Im Betriebsbereich muss das Chromatografiesystem eine lineare Reaktion ergeben. Die lineare Reaktion ist bei einer konstanten (der normalen) Konzentration des internen Standards und unterschiedlichen Tryptophankonzentrationen zu messen. Die Größe des Tryptophan- und des internen Standardpeaks müssen sich innerhalb des linearen Bereichs des HPLC-/Fluoreszenzsystems befinden. Sollten der Tryptophan- und/oder der interne Standardpeak/die internen Standardpeaks zu klein oder zu hoch sein, ist die Analyse mit einer anderen Probengröße und/oder einem anderen Endvolumen zu wiederholen.

9.3. Bariumhydroxid

Älteres Bariumhydroxid ist schwerer löslich. Dies kann zur Folge haben, dass die Lösung für die HPLC-Bestimmung nicht klar ist und zu niedrigen Tryptophan-Werten führen kann.

weiter .